6. Встановлена залежність збереженості структурної цілісності та функціональних властивостей тромбоцитів від швидкості охолодження у температурному інтервалі кристалізації (від 0/-1,5 до -35…-40 єC). Значення фактору швидкості охолодження в даному температурному інтервалі зростає зі зменшенням вмісту кріопротектора у складі кріозахисного середовища, а особливо – за його відсутності. Процедура температурної ініціації кристалізації сприяла підвищенню ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів лише за умови наступного застосування певної контрольованої швидкості охолодження. Розроблена програма заморожування концентратів тромбоцитів, яка передбачає процедуру температурної ініціації кристалізації з подальшим охолодженням зі швидкістю 6 – 7 °С/хв в даному температурному інтервалі.
7. Експериментально доведена важливість застосування контрольованої швидкості охолодження в зоні евтектичних температур (від -35…-40 до -80 єC). Порівняльний аналіз результатів кріоконсервування концентратів тромбоцитів з диметилсульфоксидом виявив залежність ступеня пошкодження тромбоцитів від швидкості охолодження в даному температурному інтервалі: спостерігалася тенденція до підвищення збереженості тромбоцитів при охолодженні із швидкістю 25 – 30 єC/хв у порівнянні із швидкостями 0,5 – 1 °С/хв, 5 – 7 °С/хв, 10 – 15 °С/хв та достовірні відмінності у порівнянні зі швидкістю, що реалізується при прямому зануренні в рідкий азот.
8. Заморожування тромбоцитів за розробленою програмою у середовищі, що містить комбінацію диметилацетаміду з 1,2-пропандіолом у кінцевій концентрації 0,7 М, підвищує рівень збереженості структурної цілісності і функціональних властивостей тромбоцитів після кріоконсервування порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо.
9. Експериментально визначені умови підвищення ефективності кріоконсервування концентратів тромбоцитів людини є реальною основою подальшої розробки і впровадження в роботу низькотемпературних банків крові технології їх довгострокового низькотемпературного зберігання для використання у практичній медицині.
ПЕРЕЛІК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Компанієць А.М., Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Погребняк М.Л. Дослідження морфофункціональної збереженості тромбоцитів на етапах кріоконсервування // Проблемы криобиологии. – 2006. – Т. 16, № 2. – С. 182 – 191.
2. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Нікітченко Ю.В., Компанієць А.М. Дослідження антирадикальних властивостей кріопротекторів та їх впливу на інтенсивність ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма” // Медична хімія. – 2006. – Т. 8, № 3. – С. 25 – 28.
3. Книш О.В., Гуріна Т.М., Богданчикова О.А., Овсянніков С.Є., Нікітченко Ю.В., Компанієць А.М. Вплив кінетики охолодження на результати кріоконсервування тромбоцитів крові людини // Міжвідомчий збірник “Гематологія і переливання крові”, випуск 33. – К.: Нора-друк, 2006. – С. 113–118.
4. Книш О.В. Вплив вихідного морфофункціонального стану тромбоцитів на результати їх кріоконсервування // Актуальні проблеми сучасної медицини. Вісник Української медичної стоматологічної академії. – 2007. – Т. 7, випуск 3 (19). – С. 170 – 173.
5. Пат. № 15014 Україна, МПК8 А0N 1/02. Спосіб видалення кріопротектора із суспензії тромбоцитів / Грищенко В.І., Компанієць А.М., Книш О.В. / Заявл. 18.11.05; Опубл. 15.06.06, Бюл. № 6.
6. Овсянников С.Е., Кныш О.В., Никитченко Ю.В., Компаниец А.М. Исследование антиоксидантных свойств криопротекторов различных классов химических соединений // Сборник трудов “Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека”. – Смоленск, Россия, 2005. – С. 366 – 368.
7. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Компанієць А.М. Дослідження впливу кріопротекторів на рівень спонтанного та індукованого іонами заліза ПОЛ у системі тромбоцити-плазма-кріопротектор // Український біохімічний журнал. – 2005. – Т. 77, № 5. – С. 143.
8. Книш О.В., Овсянніков С.Є., Компанієць А.М. Порівняльна характеристика антирадикальних властивостей кріопротекторів у системах: модельній та “тромбоцити-плазма” // Проблемы криобиологии. – 2005. – Т. 15, № 4. – С. 740 – 741.
9. Овсянников С.Е., Кныш О.В., Линник Т.П., Компаниец А.М. Зависимость антирадикальной активности криопротекторов ряда полиолов и их оксиэтильных производных от химической структуры // Збірник матеріалів ІХ Українського біохімічного з’їзду. – Харків, 2006. – Т. 1. – С. 156 – 157.
АНОТАЦІЇ
Книш О.В. Дослідження впливу факторів кріоконсервування на морфофункціональні властивості тромбоцитів людини. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 – кріомедицина. – Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.
Дисертація присвячена вивченню впливу ряду факторів кріоконсервування на структурну цілісність та функціональні властивості тромбоцитів крові людини на етапах низькотемпературного консервування. Досліджено здатність кріопротекторів різних класів хімічних сполук перехоплювати гідроксильні радикали у модельній системі їх генерації та впливати на інтенсивність процесів ПОЛ у системі “тромбоцити-плазма”. Показано, що вихідний морфофункціональний стан тромбоцитів, композиційний склад кріозахисного середовища і швидкість охолодження суспензії клітин в температурному інтервалі кристалізації та зоні евтектичних температур мають визначальний вплив на параметри структурної цілісності та функціональні властивості кріоконсервованих тромбоцитів. Вперше експериментально доведено, що застосування комбінації ДМАЦ з 1,2-ПД підвищує ефективність кріоконсервування тромбоцитів порівняно із застосуванням кожного з кріопротекторів окремо. Встановлена можливість ефективного кріоконсервування концентратів тромбоцитів, виділених з лейко-тромбоцитарного шару, які зберігалися упродовж 18 – 24 годин при температурі 22±2 єС.
Ключові слова: тромбоцити, кріоконсервування, кріопротектори, ПОЛ, програми заморожування.
Аннотация
Кныш О.В. Влияние факторов криоконсервирования на морфофункциональные свойства тромбоцитов человека. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.35 – криомедицина. – Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.
Диссертационная работа посвящена изучению влияния ряда факторов криоконсервирования на структурную целостность и функциональные свойства тромбоцитов крови человека на этапах низкотемпературного консервирования. Показана зависимость сохранности структуры и функций криоконсервированных тромбоцитов от степени активации/травматизации на этапе выделения КТ из донорской крови. Выделение КТ методом из лейко-тромбоцитарного слоя вызывает меньшую активацию тромбоцитов, что подтверждается более низким содержанием в концентрате активированных форм и агрегатов, менее выраженной микровезикуляцией и высокими показателями гранулярности тромбоцитов по сравнению с КТ, выделенными методом из обогащенной тромбоцитами плазмы. Результатом менее выраженной активации тромбоцитов на этапе выделения явился более высокий уровень сохранности их структурной целостности и функциональных свойств после криоконсервирования.
В сравнительном аспекте исследованы антирадикальные свойства криопротекторов, принадлежащих к различным классам химических соединений, по их способности к перехвату гидроксильных радикалов в модельной системе. Показано, что способность криопротекторов влиять на процессы ПОЛ в системе “тромбоциты-плазма” определяется их химической структурой и концентрацией. Не обнаружено зависимости между антирадикальной активностью криопротекторов в модельной системе и характером их влияния на процессы ПОЛ в системе “тромбоциты-плазма”.
Выделены факторы, которые имеют определяющее значение для результатов криоконсервирования тромбоцитов – состав криозащитной среды и скорость охлаждения криобиологической системы в интервале кристаллизации и зоне эвтектических температур. Теоретически обоснована и экспериментально разработана программа замораживания КТ с оптимальными скоростями прохождения температурного интервала кристаллизации. Показано, что большое значение для результатов криоконсервирования имеет такжеконтролируемая скорость охлаждения КТ в зоне эвтектических температур.
Впервые экспериментально установлена целесообразность применения при замораживании тромбоцитов комбинации ДМАЦ и 1,2-ПД. Использование данной комбинации криопротекторов в конечной концентрации 0,7 М и разработанной программы замораживания позволяет значительно повысить уровень сохранности структурной целостности и функциональных свойств криоконсервированных тромбоцитов по сравнению с использованием каждого из криопротекторов отдельно.
Разработан новый способ максимального удаления криопротекторов из суспензии тромбоцитов, обеспечивающий минимальную механическую и осмотическую нагрузку на кровяные пластинки.
Ключевые слова: тромбоциты, криоконсервирование, криопротекторы, ПОЛ, программы замораживания.
ANNOTATION
Knysh O.V. Effect of cryopreservation factors on morphofunctional properties of human platelets. – Manuscript.
Thesis for obtaining scientific degree of the candidate of medical sciences (PhD equivalent) on specialty 14.01.35 – cryomedicine. – Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, 2008.
The thesis covers studying the effect of some cryopreservation factors on structural integrity and functional properties of human blood platelets at low temperature preservation stages. The ability of cryoprotectants of different classes of chemical compounds to scavenge the hydroxyl radicals in model system of their generation and to affect the intensity of LPO processes in the “platelets-plasma” system was investigated. It has been shown that initial morphofunctional state of platelets, compositions of cryoprotective medium and cooling rate of cell suspension within temperature crystallization interval and zone of eutectic temperatures have a crucial effect on the parameters of structural integrity and functional properties of cryopreserved platelets. For the first time it was experimentally proved that use of combination of DMAC with 1,2-PD increased the cryopreservation efficiency of platelets if compared to the application of each cryoprotectant separately. The possibility of effective cryopreservation of platelet concentrates prepared by the buffy coat method and stored for 18 –24 hrs at 22 ± 2 єC was found.
Keywords: platelets, cryopreservation, cryoprotectants, LPO, freezingprograms.