5. Kordyum V., Toporova O., Novikova S., Kozel Iu.(Gilchuk Iu.), Lihachova L., Morgunov P., Irodov D. In vivo gene transfer of human APOA1 genomic DNA results in markedly high transient expression in model animal // XXX Annual ESAO Congress, Abstract book. – Aachen (Germany), 2003. – P. 664. Особистий внесок здобувача – тестування специфічності зв’язування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини методом Вестерн-блот аналізу; визначення наявності АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів.
6. Kozel Iu.(Gilchuk Iu.), Suchorada H., Toporova O., Irodov D. Expression of human APOA1 gene in mammalian cells in vitro // Conference for students, PhD students and young scientists, Abstract book. – Kiyv (Ukraine), 2003. – P. 168.Особистий внесок здобувача – визначення методом ELISAрівня синтезу АРОА1 людини трансфікованими клітинами СНО-К1.
7. Kozel Iu.(Gilchuk Iu.), Morgunov P., Toporova O., Irodov D., Novikova S., Kordyum V. Testing of transgene delivery and biodistribution by PCR-analysis // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology, Abstract book. – Lviv (Ukraine), 2004. – P. 226.Особистий внесок здобувача – оптимізація умов ПЛР аналізу гена АРОА1 людини в ДНК трансфікованих клітин щурів; виділення ДНК із зразків тканин різних органів піддослідних тварин; ПЛР аналіз тотальної ДНК тканин різних органів піддослідних щурів.
8. Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Morgunov P., Toporova O., Irodov D., Novikova S. Testing of transgene delivery and biodistribution by PCR-analysis // XXXI Annual ESAO Congress ”Towards medicaltechnology of the future”, Int. J. Artif. Organs. – 2004. –Vol. 27, № 7. – Р. 591. Особистий внесок здобувача – виділення ДНК із зразків тканин різних органів піддослідних тварин; ПЛР аналіз ДНК тканин різних органів піддослідних щурів.
9. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К. Вивчення експресії гена ароА-1 людини під регуляцією різних гібридних послідовностей в СНО-К1 // Матеріали конференції-конкурсу робіт молодих учених, присвяченої 100-річчю від Дня народження В. О. Бєліцера „Актуальні проблеми біохімії та біотехнології – 2006”. – C. 7. Особистий внесок здобувача – конструювання рекомбінантних плазмід; тестування характеристик зв’язування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини методами ELISA та Вестерн-блот аналізу; дослідження культуральних середовищ клітин СНО-К1, трансфікованих препаратом ДНК/ПЕІ.
10. Novikova S., Toporova O., Gilchuk Iu., Kordyum V. Non-viral gene delivery of human APOA1 into mammalian cells in vitro and in vivo // XIV Annual Congress of the European Society of Gene Therapy, Abstract book. – Athens (Greece), 2006. – Р. 157.Особистий внесок здобувача – ПЛР аналіз ДНК трансфікованих клітин; виявлення АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів та культуральному середовищі трансфікованих клітин.
АНОТАЦІЯ
Гільчук Ю. М. Ефекти, обумовлені введенням у клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну А-1 людини. – Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 – молекулярна генетика. – Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, Київ, 2008.
Дисертацію присвячено дослідженню ефектів, обумовлених введенням плазмідної ДНК з геном АРОА1 людини, на культурі клітин та тваринах. У результаті роботи сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, які містять геномний варіант гена АРОА1 людини під регуляцією промоторів hCMV-ІЕ, hCMV-ІA та CAG. При дослідженні пулів стабільно трансфікованих клітин СНО-К1 показано, що промотори hCMV-ІA та CAG забезпечують вищий рівень експресії АРОА1 людини порівняно з hCMV-ІЕ. Виявлено, що трансген, введений в організм піддослідних тварин ін'єкцією у паренхіму печінки у складі комплексів плазміди з поліетиленіміном (ПЕІ), потрапляє крім печінки до інших органів. А також, зберігається у клітинах печінки щурів та кролів щонайменше 25 діб та 85 діб, відповідно. Встановлено, що введення гена АРОА1 людини під контролем hCMV-ІЕ, у складі комплексів з ПЕІ у печінку кролів, призводить до накопичення АРОА1 людини у крові тварин та зниження рівня атеросклеротичного пошкодження тканин досліджуваних органів і вмісту тотального холестерину у крові порівняно з контрольною групою кролів при утримані тварин на холестериновій дієті.
Ключові слова: аполіпопротеїн А-1, поліетиленімін, трансген, експресія.
АННОТАЦИЯ
Гильчук Ю.Н.Эффекты, обусловленные введением в клетки млекопитающих трансгена аполипопротеина А-1человека. – Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 – молекулярная генетика. – Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2008.
Диссертация посвящена исследованию эффектов, обусловленных введением плазмидной ДНК с геном АРОА1 человека, на культуре клеток и животных. В результате работы сконструировано серию рекомбинантных плазмид, содержащихгеномный вариант гена АРОА1 человека под регуляцией промоторов hCMV-ІЕ, hCMV-ІA и CAG. При исследовании пулов стабильно трансфицированных клеток СНО-К1 показано, что промоторы hCMV-ІA и CAG обеспечивают более высокий уровень экспрессии АРОА1 человека в сравнении с hCMV-ІЕ. Продемонстрировано, что трансген, введенный в организм животных инъекцией в паренхиму печени в составе комплексов плазмиды с полиэтиленом, попадает кроме печени в другие органы. А такжесохраняется в клетках печени крыс и кролей наименьше 25 и 85 суток, соответственно. Установлено, что введение гена АРОА1 человека под контролем hCMV-ІЕ, в составе комплексов плазмида/ПЕІ в печень кролей, приводит к накоплению АРОА1 человека в крови животных иснижает уровни атеросклеротического повреждения исследуемых органов и содержания тотального холестерина в крови животных в сравнении с контрольной группой кроликов при содержании кролей на холестериновой диете.
Ключевыеслова: аполипопротеин А-1, полиэтиленимин, трансген, экспрессия.
SUMMARY
Gilchuk Iu. M. The effects caused by injection of human apolipoprotein A-1 transgene into mammalian cells. –Manuscript.
Thesis for a Philosophy Doctor (PhD) degree in Biology, speciality 03.00.22 – molecular genetics. – Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2008.
The elaboration of methods of genes delivery into somatic cells is the foundation of gene therapy development. There is necessity to develop new and more effective vectors as well as corresponding methods of gene delivery into target tissues. The plasmid vectors, which may be applied at cells transfection by physical or chemical methods, do not have disadvantages, inherent to virus vectors, though they are characterized by much lower effectiveness of transfection in vivo in comparison with the latter at their usage for genes transfection in vivo. The analysis of distribution of plasmid molecules in tissues and transgene expression are constituent parts of valuation of effectiveness of gene therapy methods for a target gene delivery. To correct disorder, caused by the deficiency of expression of a specific gene in the organism, high level of expression of a target transgene is often necessary to achieve physiological concentrations of the protein and therapeutic effect correspondingly. It was shown that the expression level of genes, introduced into mammalian cells, depends on many reasons, including the strength of transcription regulatory elements. One of the perspective strategies of solving the problem, connected with a low level of transgenes expression, is optimization of already known regulatory sequences and search for stronger ones. To some degree it might solve the problem of low effectiveness of cells transfection by the plasmid vectors.
The goal of this work was the construction of plasmid vectors, containing genome variant of human apolipoprotein A-1 (APOA1) gene under the transcriptional control of different elements, as well as the study of transient expression of human APOA1 gene in CHO-K1 cells, the examination of the transportation and the distribution of human APOA1 containing plasmid DNA, as a part of complexes of DNA/polyethyleneimine (PEI) in rats and rabbits, the investigation of the time course clearance of target gene and human APOA1 expression in vivo.
The recombinant plasmids containing the genomic human APOA1 gene under the transcriptional control of promoters, namely, the cytomegalovirus immediate early enhancer/chicken β-actin promoter and first intron (CAG promoter) and cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter with intron A (hCMV-IA promoter) have been constructed. The transient expression of human APOA1 gene has been studied in CHO-K1 cells using designed and pTRhCMV-IEapo (cytomegalovirus immediate early enhancer/ promoter (hCMV-EI)) vectors. The expression of the transgene for transfected with pTRhCMV-IEapo and pTRhCMV-IAapo CHO-K1 cells have been shown. The expression of human APOA1 on the level of ~0,4 and ~3 ng of protein per 1 ml of the medium was shown for CHO-K1 cells, transfected correspondingly by pTRhCMV-IEapo and pTRhCMV-IAapo plasmids on the 2 nd day after the transfection.
The recombinant plasmids (pTRhCMV-IEapo-neoR, pTRhCMV-IAapo neoR and pTRCAGapo neoR), containing neomycinphosphotransferase gene (neoR), have been constructed for obtaining stable transformants. The expression of human APOA1 gene for all pools of stable transformants has been detected. The higher level of expression of the transgene for pools obtained by transfection with pTRhCMV-IAapo neoR and pTRCAGapo neoR than with pTRhCMV-IEapo-neoR has been shown.
The study of the transfer of the plasmid DNA, containing human APOА1 gene, in complex with PEI into rat and rabbit liver parenchyma and time period of transgene clearance in vivo has been performed. The presence of human APOA1 gene was revealed in genetic material, in all organs of experimental animals, the tissues of which had to be analyzed (liver, heart, lungs, kidneys, aorta and lymph nodes). The result obtained may testify in favour of indirect DNA transfer and may be explained by the fact that the part of liver-introduced plasmid DNA gets into the blood stream with intercellular liquid and lymph or with venous blood through capillaries, and is spread in organism. The presence of human APOA1 gene was discovered over the time of 25th and 85th days after plasmid injection in total DNA of liver cells rat and rabbit, accordingly.
There are two issues that make the APOA1 human protein analysis more difficult, namely, blood containing animal AроA1 in rather high concentration and molecular weight of APOA1, which does not differ essentially for different species. The selection of system of reagents for immune-chemical detection of human APOA1 protein in blood plasma of rabbits using both ELISA and Western-blot was the part of our work. Therefore, we have optimized the Western-blot method of detection for human APOA1 in blood of rabbits.
Investigating the synthesis of human APOA1 in vivo the rabbits under investigation were divided into two groups. The first group of rabbits was introduced repetitive injection of human APOA1 gene as a part of pTRhCMV-IEapo vector, the second group (control) − repetitive injection of pTR plasmid containing no target gene. All rabbits have been fed a cholesterol-rich diet from day of plasmid injection. On the 6th day after injection, human APOA1 protein in blood plasma of first group of rabbits was detected using the Western-blot method, while in blood plasma of the second group of rabbits it was not detected (sensitivity of Western-blot method was ~ 1 μg of human protein/ml of rabbit blood plasma). Having performed quantitative assessment of transgene expression, the concentration of human APOA1 in blood plasma was 1,6–20,2 μg/ml from rabbit to rabbit. It has been shown that repetitive injection of plasmid DNA, containing human APOA1 gene, in the complex with PEI into the liver parenchyma of cholesterol-rich diet rabbits influenced cholesterol concentration in animal blood and morphology of tissues. Thus, APOA1 injected animals were shown not to reveal the increase in total cholesterol concentration in blood and morphology alteration of liver and vessel tissues, specific for atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits.
Key words: apolipoprotein A-1, polyethylenimine, transgene, expression.