Практичне значення одержаних результатів. Позитивні результати використання комбінованого органотипового культивування тканин ЩЗ, НЗ і гіпофізу в даному дослідженні обґрунтовують доцільність практичного застосування зазначеного методу на етапі передобробки трансплантаційного матеріалу з метою поліпшення його гормональної активності, зниження імуногенності та подовження термінів функціонування графту в організмі реципієнта.
Можливе клінічне застосування методу комбінованої трансплантації тканин щитоподібних і надниркових залоз в лікуванні первинного гіпотиреозу лабільного перебігу, в стадії декомпенсації, при неефективності терапії синтетичними гормональними монопрепаратами (L-тироксин), з огляду на відсутність в патогенезі захворювання аутоімунного компонента, а також для лікування первинного гіпотиреозу з супутньою недостатністю надниркових залоз, що виникла на тлі глюкокортикоїдної терапії.
Нові дані щодо компенсаторного впливу комбінованої трансплантації двох видів ендокринних тканин мають значення для розвитку тканинної та клітинної трансплантології, клінічної та експериментальної ендокринології і ендокринної хірургії.
Встановлення стимулюючої дії кортикостерону на Т4-гормонопоез in vitro та in vivo, наявності сигнально-регуляторних зв’язків між ЩЗ та гіпофізом, як в моделі in vitro, так і за умов трансплантації сприятимуть розвитку сучасних уявлень про взаєморегуляцію ендокринних залоз.
Результати досліджень використовуються у навчальному процесі при викладанні дисципліни “Фізіологія сільськогосподарських тварин”, розділу “Фізіологія ендокринної системи” студентам факультету ветеринарної медицини Сумського національного аграрного університету та можуть бути використані для викладання курсів нормальної,
патологічної фізіології та ендокринології на біологічних факультетах університетів та у медичних вищих учбових закладах, а також у роботі науково-дослідних установ ендокринологічного профілю.
Особистий внесок здобувача. Представлені на захист положення і експериментальні дані отримані при безпосередній участі дисертанта, яка полягає в самостійному плануванні дослідження, проведенні серії експериментів in vitro та in vivo, розробці та застосуванні методу комбінованого культивування, інтерпретації і математичному аналізі отриманих результатів, формулюванні висновків.
Автор висловлює подяку співробітникам відділу кріобіохімії і фармакології нейрогуморальних систем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.
Апробація результатів дисертації. Основні положення та результати роботи викладені та обговорені на засіданнях відділу кріобіохімії та фармакології нейрогуморальних систем Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України та на засіданні вченої ради біологічного факультету Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна; матеріали дисертації представлені на наукових конференціях: IІІ и IV Данилевських читаннях (Харків, 2004, 2005 р.р.), Установчому з’їзді Українського товариства клітинної біології з міжнародним представництвом (Львів, 2004 р.), конференціях молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології” (Київ, 2004, 2005 р.р.), 5th Parnas Conference "Molecular Mechanisms of Cellular Signalling" (Kyiv, 2005), конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур” (Харків, 2005 р.), науково-практичній конференції з участю міжнародних фахівців “Актуальні питання абдомінальної та судинної хірургії. Клінічні проблеми трансплантації органів” (Київ, 2006 р.), 18th European Student’s Conference “Promising Medical Scientists Willing to Look Beyond” (Berlin, 2007).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт, у тому числі 6 статей, 4 із яких – у фахових виданнях, 10 тез доповідей.
Обсяг і структура дисертації. Матеріал викладено на 167 сторінках друкованого тексту, в тому числі на 29 сторінках цитована література, проілюстровано 23 рисунками, 4 таблицями і 31 мікрофотографією. Дисертаційна робота містить вступ, основну частину, яка складається з трьох розділів (огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати власних досліджень та їх обговорення), висновки і бібліографічний список, який включає 295 джерел, в тому числі 236 іншомовних.
Основний зміст роботи
Матеріали і методи дослідження. Робота виконана на щурах лінії Вістар (самках), віком 3 місяці, вагою 165-215 г, використаних в якості реципієнтів для проведення ауто-, ало- і ксенотрансплантацій. Експерименти на лабораторних тваринах проводились відповідно принципам Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (1964-2000 р.р.), Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (1997 р.), відповідним положенням ВООЗ, Міжнародної ради медичних наукових товариств, вимогам та нормам 1СН С8Р (2002 р.), типовим положенням з питань етики МОЗ України № 281 від 1 листопада 2000 р., відповідно до положень нормативних документів, введених в дію наказом МОЗ України № 6 від 17 січня 1995 р., а також вимогам “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та наукових цілях” (1986 р. № 123).
Трансплантаційний матеріал, у вигляді комбінованих і монографтів, представлено НФ і органотиповими культурами ендокринних залоз (ЩЗ, НЗ і гіпофізу) статевозрілих щурів і новонароджених поросят (НП). На етапі передобробки трансплантаційного матеріалу проводилось органотипове культивування ендокринних тканин, комбіноване культивування і культивування в присутності модифікаторів гормонопоезу. Для цього в асептичних умовах отримували органні фрагменти із ендокринних залоз щурів і новонароджених поросят розміром 0,5-1 мм3, культивували їх за стандартною методикою (Грищенко В.І. та ін., 2000) протягом 4 діб на живильному середовищі 199/RPMI, збагаченому 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби і йодидом калію (75 мкг/л) з додаванням пеніциліну (100 ОД/мл) і канаміцину/стрептоміцину (100 мкг/мл) при температурі 37 єС в атмосфері 5% СО2. Для комбінованого культивування 2 видів ендокринних тканин на 3 добу фрагменти ЩЗ і НЗ, а також ЩЗ і експлантати гіпофізу відокремлювали напівпроникливою мембраною і інкубували 24 години, дотримуючись стандартних умов. Для визначення здатності ОКЩЗ відповідати на дію модифікаторів гормонопоезу, на 3 добу культивування в середовище додавали ТТГ (10 мкМО/мл (Sadeh K. et al., 1991)) та інкубували 12 годин при температурі 37єС, тиротропін-рилізинг гормон (ТРГ) в 2 концентраціях (10 нмоль (4,4 нг/мл)) – на 12 годин (Weintraub B.D. et al., 1990) і 200 мкг/мл – на 2 години інкубації (Cheolyoung P. et al., 2005)), дибутирил-циклічного аденозинмонофосфату (дб-цАМФ) (1 ммоль/мл), кортикостерон (в діапазоні концентрацій від 0,25 до 1,0 мкг/мл (Резников А.Г., 1980)). Крім того, ОКЩЗ і ОКНЗ окремо культивували в стандартних умовах протягом 3 діб, а потім інкубували 12 годин, відокремлюючи фрагменти напівпроникливою мембраною в присутності ТТГ і дб-цАМФ у вищезазначених концентраціях. ОКЩЗ і експлантати гіпофіза інкубували з ТРГ (4,4 нг/мл – 12 годин і 200 мкг/мл – 2 години).
Життєздатність культур визначали на останню добу культивування методом суправітального забарвлення трипановим синім клітинної суспензії, отриманої методом ферментативної дезагрегації. Кількість життєздатних клітин (ЖК, %) визначали шляхом підрахунку в гемоцитометрі (Адамс Р., 1983) і знаходили за формулою: ЖК = (∑незабарвл/∑заг) х 100,де ∑незабарвл – кількість живих (незабарвлених) клітин, ∑заг – загальна кількість клітин в полі зору.
Післяопераційний гіпотиреоз моделювали за допомогою ретроградної тиреоїдектомії (Легач Е.И., 2005) під комбінованим внутрішньочеревним наркозом (кетамін - 2,5 мг, ксилазин – 0,5 мг/100г маси тіла). З метою запобігання порушення кальцієвого обміну тваринам давали 0,2% розчин кальцію хлориду (Корлэтяну А.Н., 1987; Шкуматов Л.М., и др., 2001).
Трансплантаційний матеріал у дозі 30-35 мг вносили під капсулу нирки. У випадку комбінованої трансплантації з НЗ тваринам здійснювали лівосторонню адреналектомію.
Сакрифікацію тварин проводили на 30 добу після трансплантації під ефірним наркозом. Кров для аналізу брали за допомогою внутрішньосерцевої пункції.
Вміст загального рівня тироксину (Т4) в плазмі крові тварин-реципієнтів і середовищі культивування дослідних зразків ОКЩЗ визначали методом радіоімунологічного аналізу з використанням стандартних тест-наборів РИА – Т4 – СТ (Білорусь) (Прядко К.А. и др., 2000) и Т4 Immunotech (Чехія) згідно з інструкцією.
Показники концентрації Т4 в середовищі культивування ОКЩЗ нормували на білок, який вимірювали за методом Бредфорда (Bradford, 1976).Рівень ТТГ в плазмі крові щурів-реципієнтів визначали з використанням набору для РІА - ТТГ «Ирма» REF (Угорщина).
Тест толерантності до вуглеводів проводили шляхом внутрішньочеревного введення розчину глюкози (0,1 г глюкози на 100-150 г маси тіла тварини) за 40 хвилин до сакрифікації (Громакова І.А. и др., 2002). Рівень глюкози в крові вимірювали фотоколориметричним методом в модифікації Н.В. Клімкіної (Пушкина Н.Н., 1963) та експрес-методом за допомогою глюкометру “Глюкофот” та індикаторних пластин “Гемоглан” (Україна).
Рівень альбуміну в плазмі крові визначали фотоколориметричним методом за реакцією з бромкрезоловим зеленим стандартним тест-набором Альбумин “Филисит Диагностика” (Україна), рівень холестерину - набором Chol 150 “Lachema” (Чехія) згідно з інструкціями. Фотоколориметричні визначення проводили з використанням ФЕК (КФК-2-УХЛ42).