2. Сапонины гидролизуются ферментами и кислотами.
3. С кислотными реагентами (конц. Кислота серная, кремневольфрамовая, уксусный ангидрид, сурьма трехвалентная и др.) сапонины образуют окрашенные продукты за счет образования ненасыщенных (полиеновых) сопряженных структур.
4. Кислые сапонины, производные олеаноловой, урсоловой, глицирризиновой и др. кислот взаимодействуют со щелочами, а также солями тяжелых металлов (свинец, барий и др.), образуя не растворимые в воде осадки.
5. Стероидные сапонины спиростанового типа дают осадки с холестерином.
На физических, биологических и химических свойствах сапонинов основаны методы их анализа.
Сапонины достоверно обнаружены в представителях примерно 40 семейств.Более широко распространены тритерпеновые сапонины. Чаще всего они встречаются у растений сем. Caryophyllaceae, Fabaceae (солодки, астрагал шерстистоцветковый), Araliaceae (женьшень, аралия маньчжурская), Hippocastanceae (каштан конский), Polygonaceae (сенега), Rosaceae (лапчатки прямостоячая, кровохлебка лекарственная), Asteraceae (календула лекарственная) и др. Стероидные сапонины чаще встречаются у растений сем. Dioscoreaceae (диоскореи), Agavaceae (агавы, юкки), Liliaceae (ландыш), Scrophulariaceae (наперстянки), Zygophyllaceae (якорцы стелющиеся) и др. Из 250 выделенных стероидных сапонинов около 170 соединений относятся к спиростановому типу. В растениях сапонины находятся в различных органах растений, чаще в подземных, в растворенном виде в клеточном соке. Агликоны тритерпеновых сапонинов (урсоловая, олеаноловая кислота) встречаются в кутикуле, перидерме. При сборе, сушке и хранении сырья нужно создать условия, препятствующие ферментативному гидролизу сапонинов. Надземные части собирают в сухую погоду, в небольшую по объему тару (лучше корзины, ящики с отверстиями) и быстро, через 2-3 часа (чтобы не произошло самосогревание сырья) доставляют к месту сушки. Сушка для большинства видов рекомендуется быстрая, в тонком слое, при температуре 50-700. Можно при этой температуре выдержать сырье 1-2 часа, а затем, после дезактивации ферментов, досушивать его при обычной температуре. Сырье хранится в сухом, прохладном месте по общему списку.
Все сапонины за счет рефлекторного раздражения слизистых оболочек обладают отхаркивающим, мочегонным, слабительным действием.
Стероидные сапонины являются исходным продуктом для синтеза гормональных препаратов (кортизона, прогестерона и др.) Кроме того, отдельные сапонины обладают антисклеротическим, гипотензивным (диоскореи, якорцы стелющиеся, пажитник сенной), контрацептивным (агавы), антиоксидантным действием. Некоторые сапонины блокируют рост злокачественных опухолей (париллин из видов смилакса).
Отдельные сапонины проявляют тонизирующее, стимулирующее, адаптогенное действие (женьшень, аралия маньчжурская); антиаллергическое, регулирующее водно-солевой обмен (солодки), Р-витаминное (каштан конский), седативное (синюха голубая) и др.
В растениях обычно содержится несколько близких по строению и свойствам гликозидов, разделение и идентификация которых до настоящего времени представляют собой сложную и не всегда разрешимую задачу.
Анализ сырья складывается из нескольких стадий: экстракция сапонинов из сырья, очистка полученного извлечения, разделение на индивидуальные компоненты. Экстрагируют сапонины из сырья обычно полярными растворителями: метанолом и этанолом различной концентрации, водой, 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Иногда сырье перед экстракцией обрабатывают петролейным эфиром, четыреххлористым углеродом, диэтиловым эфиром для разрушения нерастворимых в полярных растворителях комплексов сапонинов со стеринами, белками, фенольными соединениями. Очистку полученных извлечений проводят различными способами, что зависит от структуры сапонинов. Полярные сапонины плохо растворимы в этиловом и метиловом спиртах, выпадают в осадок при охлаждении, длительном стоянии спиртового экстракта или при добавлении этанола. Гликозиды с небольшой углеводной цепочкой обычно плохо растворимы в воде и выпадают в осадок при разбавлении спиртовых экстрактов водой. Кислые тритерпеновые сапонины растворимы в водных растворах щелочей и выпадают в осадок при подкислении. Также из спиртовых растворов тритерпеновые сапонины можно осаждать диэтиловым эфиром, ацетоном, этилацетатом, иногда бутиловым и изоамиловым спиртами. Полученную сумму сапонинов очищают повторным переосаждением от полярных сопутствующих веществ: моно- и олигосахаридов, фенольных соединений, органических кислот и др.
Ряд методов основан на способности сапонинов образовывать нерастворимые в воде или водном спирте соли с гидроксидом бария или ацетатом свинца и комплексы с холестерином, танинами, белками. Затем эти соли или комплексы разлагают.
Эти методы позволяют получить более чистую сумму сапонинов.
Качественный анализ
1. Реакция гемолиза. Готовят извлечение на изотоническом растворе натрия хлорида 1 : 30 настаиванием на кипящей водяной бане в течение 30 минут. К 2 мл извлечения добавляют 2 мл 2% взвеси дефибринированной крови. В присутствии сапонинов образуется прозрачный красный раствор ("лаковая кровь").
2. Реакция пенообразования. Водное извлечение из сырья (1 : 10) встряхивают в пробирке в течение 15 сек. Не исчезающая в течение 15 мин пена говорит о возможном присутствии сапонинов.
3. Хроматография в тонком слое. Водное или спиртовое извлечение хроматографируют на силикагеле или алюминия оксиде в подходящей системе растворителей. Для нейтральных сапонинов чаще всего используют н-бутанол – уксусная кислота – вода, для кислых – н-бутанол – водный аммиак в различных соотношениях. Систему подбирают экспериментально. На хроматограммах сапонины обнароуживают, проявляя различными кислотными реагентами: конц. Кислота серная, уксусный ангидрид, 25% раствор фосфорномолибденовой кислоты, треххлористая сурьма и др., часто в сочетании с кобальта хлоридом, ванилином, пара-диметиламинобензальдегидом и др.
Тритерпеновые сапонины проявляются в виде красновато- или буроватофиолетовых пятен.
Стероидные сапонины при проявлении хроматограмм 1% раствором сурьмы треххлористой, конц. кислотой серной и уксусным ангидридом образуют желтые (спиростановые) пятна (реакция Санье). В настоящее время хроматографический метод дает наиболее достоверное представление о наличии сапонинов в сырье.
4. Реакция Лафона. К 2 мл спиртового извлечения добавляют 1 мл кислоты серной концентрированной, 1 мл этанола и 1 каплю 10 % раствора железа сульфата. В присутствии сапонинов образуется сине-зеленое окрашивание.
5. При добавлении к 2 мл водного извлечения 1 мл 10% раствора натрия нитрата и 1 капли кислоты серной концентрированной образуется кроваво-красное окрашивание.
6. При добавлении к 2 мл спиртового извлечения 1 % раствора холестерина образуется белый осадок.
Количественное определение
Единого точного метода количественного определения сапонинов в сырье нет, ввиду их разнообразного строения.
1. Ранее использовали гравиметрический метод, основанный на физических свойствах сапонинов: разной растворимости гликозидов и агликонов. Сапонины из сырья экстрагируют метиловым или этиловым спиртом в аппарате Сокслета. Экстракт упаривают под вакуумом, сапонины осаждают органическим растворителем; отфильтровывают, промывают, высушивают до постоянной массы и взвешивают. Результаты получаются завышенные, так как кроме сапонинов осаждаются сопутствующие вещества. Более точные результаты могут быть получены, если провести гидролиз суммы сапонинов, отделить агликоны, высушить и взвесить.
2. В настоящее время для определения суммы сапонинов и индивидуальных веществ используют физико-химические методы (спектрофотометрия, колориметрия), основанные на способности сапонинов при нагревании давать окрашенные продукты с кислотными реагентами. Например, при определении суммы сапонинов каштана конского, синюхи голубой используют кобальта хлорид с кислотой серной концентрированной; женьшеня – ванилин с кислотой серной концентрированной, стероидных сапонинов – п-диметил-аминобензальдегид в 4 моль/л растворе кислоты хлористоводородной. Калибровочные графики строят по стандартному образцу (например, эсцину) или кобальта хлориду. Эти методы часто используют в сочетании с предварительным хроматографическим разделением суммы сапонинов. Для кислых сапонинов (например, аралозиды) используют потенциометрическое титрование после предварительного гидролиза сапонинов. Иногда для сырья, содержащего сапонины (при научных исследованиях) определяют пенное число и гемолитический индекс.
Пенное число – наименьшая концентрация извлечения из 1 г сырья, при встряхивании которого в течение 15 сек образуется устойчивая в течение 15 мин пена. Основан на физических свойствах сапонинов.
Гемолитический индекс – наименьшая концентрация извлечения из 1 г сырья или раствора чистого сапонина, которая вызывает гемолиз эритроцитов, содержащихся в 1 мл 2 % раствора дефибринированной крови барана. Извлечение сапонинов и разведение проводят изотоническим раствором. Готовится серия разведений и определяется наименьшая концентрация. При работе с кровью других животных параллельно ставят контроль со стандартным сапонином (0,02 % раствор дигитонина). Результаты выражают соотношением массы сырья (1 г) и разведения. Например 1:5000, 1:20000 и т.д.
Эти методы не дают представления о количественном (%) содержании сапонинов, а свидетельствуют о поверхностной или гемолитической активности.