Условия, способствующие образованию покоящихся клеток, до сих пор изучены недостаточно. К категории благоприятствующих факторов относится наличие или отсутствие определенных питательных веществ среды, температура, кислотность среды, условия аэрирования. Формированию цист у миксобактерий, например, способствует наличие в среде глицерина, аминокислот. Количество цист азотобактера возрастает при добавлении к среде b-оксимасляной кислоты и повышении концентрации двухвалентных катионов. В качестве факторов, индуцирующих формирование акинет цианобактерий, отмечена низкая температура, высушивание, отсутствие в среде связанного азота или, наоборот, увеличение содержания глутаминовой кислоты.
Помимо факторов внешней среды, в неодинаковой степени влияющих на формирование разных типов покоящихся клеток, обнаружены специфические вещества, основная функция которых заключается в регулировании роста и развития эубактерий, в частности в индуцировании процессов формирования покоящихся клеток. Такие вещества могут выделяться в культуральную среду или накапливаться внутри клетки. Они были выделены, и показана индукция ими спорообразования.
Сформированные покоящиеся клетки в течение разного времени могут находиться в жизнеспособном состоянии и прорастать в подходящих условиях с образованием активно метаболизирующих вегетативных клеток.
Для эндоспор процесс прорастания состоит из нескольких этапов: активации, инициации и вырастания. Как правило, эндоспоры даже в благоприятных условиях могут не прорастать. Для этого их необходимо подвергнуть активации. Наиболее общим активирующим фактором является термообработка споровой суспензии. После этого споры приобретают способность прорастать, но для начала прорастания необходим химический «пусковой» механизм.
В качестве веществ, инициирующих прорастание эндоспор, наиболее эффективны углеводы, некоторые аминокислоты и неорганические ионы.
Вопрос 2. Цели и методы выделения чистых культур
Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида [7, с. 64].
Выделение чистых культур бактерий - обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами [7, с. 64].
Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.
Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится, его идентификация.
Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп [7, с. 64].
Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).
Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 ° С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает.
Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.
Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева. Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.
Метод Дригальского - широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном.
Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга.
Через 1-7 сут. выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.
Метод Вейнберга.
Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако, чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 ° С агаризированной питательной среде.
Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают.
При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов.
Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.
Метод Хангейта - когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта.
Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.
Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора . Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля» [7, с. 70].
В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.
Основным методом является бактериологический метод, который заключается в выделении чистой культуры возбудителя (популяции, содержащей бактерии одного вида) и ее идентификации.
Под идентификацией микроорганизмов подразумевают изучение их свойств с целью установления принадлежности к той или иной систематической группе (роду, виду).
Бактериологический метод представляет собой многоэтапное исследование. В связи с тем, что исследуемый материал чаще всего содержит смесь микроорганизмов, основой бактериологического метода является выделение чистой культуры возбудителя, которое производят на первом этапе исследования. С этой целью делают посев исследуемого материала, как правило, на плотные питательные среды, выбор которых обусловливается свойствами предполагаемого возбудителя.
Применяют по возможности элективные среды, на которых растет только данный вид бактерий, или дифференциально-диагностические среды, позволяющие отличить предполагаемого возбудителя от других микроорганизмов.