Молекулярні механізми перенесення сигналів регуляторів функції кори надниркових залоз (стр. 4 из 11)
 |
 |
умовно аденома
нормальна
тканина
Рис. 2. Розподіл різних ізоформ протеїнкінази С в цитозольній (ц), мікросомній (м) та ядерній (я) субклітинних фракціях адренокортикоцитів в умовно нормальній і пухлинній тканинах надниркових залоз людини.
Ці дані узгоджуються з результатами інших авторів, які також визначали найвищий рівень експресії для α-ізоформи ПКС в адренокортикоцитах порівняно з досить незначним для інших ізоформ [Shigematsuetal., 1992].
Розподіл ПКС-a між цитозольною та мікросомальною фракціями визначається походженням тканини: в умовно нормальній тканині фермент рівномірно розподіляється між фракціями, а в аденомах (група, утворена об’єднанням всіх досліджених випадків доброякісних новоутворень) ПКС-a транслокується з цитозолю до мікросомної фракції. Найістотніша відмінність від контролю спостерігалась у випадках карцином. Для ядерної фракції не вдалося знайти певної закономірності між відносною кількістю ПКС-α та типом тканини (табл. 1). Виявлена транслокація ПКС-a розглядається нами як активація ферменту за умов дослідженої патології. Очевидно, саме ПКС-α бере активну участь у формуванні пухлин та підтримці пухлинного росту. Можливо, надекспресія цього ферменту, тривала активація ПКС внаслідок дії канцерогенних чинників або порушення метаболізму фосфоліпідних активаторів призводить до патологічної відповіді – порушення клітинного циклу та розвитку пухлин.
Отримані дані свідчать, що пухлини кори надниркових залоз характеризуються транслокацією основної ізоформи ПКС – Са2+/фосфоліпід-залежної a-ізоформи до мікросомної фракції адренокортикоцитів і збільшенням загальної активності ПКС в мікросомній фракції пухлин. На разі можна стверджувати, що α-ізоформа ПКС в надниркових залозах може брати участь у онкогенезі і слугувати маркером малігнізації.
Таблиця 1
Розподіл a-ізоформи ПКС у цитозольній, мікросомній та ядерній фракціях клітин кори та пухлин надниркових залоз людини, %
| Тип тканини | Цитозольна фракція | Мікросомнафракція | Ядернафракція |
| Умовно нормальна (8) | 46,19 ± 2,18 | 41,26 ± 1,97 | 13,62 ± 1,21 |
| Аденома (4) | 29,35 ± 3,61 | 50,40 ± 2,0 * | 17,40 ± 1,58 |
| Карцинома (4) | 26,09 ± 8,16 | 73,91 ± 8,16* | - |
Примітка. * - вірогідна різниця між цитозольною та мікросомною фракціями, р<0,05; критерій Стьюдента, кількість спостережень вказано в дужках.
Крім α-ізоформи ПКС позитивні результати було отримано для -ε, -δ, -η, -θ, -μ, -ζ ³зоформ. Розподіл ізоформ ПКС-α, -ε, -δ, -ζ μіж субклітинними фракціями наведено на рис. 2. ПКС-ε, -δ, -η, -θ, -μ βідносяться до родини нових, а ПКС-ζ до нетипових протеїнкіназ. Всі вищезгадані форми є Са2+-незалежними, їх визначення в корі надниркових залоз було проведено вперше. Рівень експресії цих ізоферментів в корі надниркових залоз людини є досить високим, хоча меншим порівняно з Са2+/фосфоліпід-залежною ПКС-α. За винятком δ-ізоформи, вони виявляються в усіх досліджуваних субклітинних фракціях – цитозольній, мікросомній та ядерній (рис. 2).
Розподіл ізоформ ПКС-ε, -δ, -ζ μіж цитозольною, мікросомальною та ядерною фракціями наведено у таблиці 2. У випадку ПКС-ε усереднені дані за всіма дослідженими групами демонструють переважний вміст ε-ізоформи ПКС у цитозольній фракції (табл. 2). Отже, розподіл протеїнкінази С-e не залежить від типу тканини і характеризується зсувом до цитозольної фракції. Транслокація ПКС-δ до мембранної фракції спостерігалась у випадку аденом. Розподіл ПКС-ζ є подібним до ПКС-e в аденомах. В умовно нормальній тканині різниця між цитозольною та мікросомною фракціями ставить менше 10 %. У аденомах відносний розподіл протеїнкінази С-ζ характеризується зсувом до цитозольної фракції. Частка ядерної фракції становить в досліджених групах 14-18 % (табл. 2).
Таблиця 2
Субклітинний розподіл ε, δ, ζізоформ ПКС у фракціях клітин кори та пухлин надниркових залоз людини, %
| Ізоформа | Тип тканини | Цитозольна фракція | Мікросомнафракція | Ядернафракція |
| ПКС-ε | Умовно нормальна (8) | 46,54 ± 2,77 | 36,31 ± 1,96 * | 17,14 ± 1,74 |
| Аденома (4) | 48,90 ± 4,64 | 33,13 ± 2,72 * | 17,98 ± 2,54 | |
| ПКС-δ | Умовно нормальна (8) | 50,49 ± 1,34 | 49,90 ± 1,34 | - |
| Аденома (4) | 36,65 ± 2,78 | 63,35 ± 2,78 * | - | |
| ПКС-ζ | Умовно нормальна (8) | 43,98 ± 2,69 | 42,00 ± 2,20 | 14,01 ± 1,26 |
| Аденома (4) | 51,98 ± 8,81 | 31,07 ± 6,62 * | 16,92 ± 2,97 |
Примітка. * - вірогідна різниця між цитозолем та мікросомною фракцією, р<0,05; критерій Стьюдента, кількість спостережень вказано в дужках.
Таким чином, отримані дані свідчать про участь ферментів родини ПКС у формуванні пухлинних патологій, оскільки процес транслокації до мембран є дуже суттєвим для активації ферменту та взагалі для існування пухлинних клітин.
Крім серин/треонінових протеїнкіназ, до яких відноситься ПКС, широко представлені в клітинах рецепторні і цитоплазматичні фосфотирозинові протеїнкінази. Зараз активно обговорюються факти щодо фенотипічного зв’язку експресії РТК в клітині зі злоякісною трансформацією і метастатичним потенціалом тканини. Ми провели оцінку експресії мРНК РТК за рахунок використання зворотної транскрипції – полімеразної ланцюгової реакції, яка свідчить про вірогідні відміни у експресії мРНК РТК між нормальною та пухлинною тканинами у карциномах кори надниркових залоз. Експресія в злоякісних пухлинах є найбільш вираженою і відрізняється від експресії мРНК РТК в доброякісних пухлинах надниркових залоз, які досліджувались (експресія спостерігалась тільки в одному випадку гормонально-активної аденоми – альдостероми). Визначення експресії РТК за допомогою зворотної транскрипції – полімеразної ланцюгової реакції може вважатись, з нашої точки зору, методом диференційної діагностики злоякісності пухлин надниркових залоз. Використання цього методу може бути перспективним для діагностики карцином адренокортикальної тканини.
Залучення МАР-кіназної системи до перенесення сигналу АКТГ.Пострецепторні етапи дії АКТГ, які полягають в перенесенні сигналу з активованого рецептора на внутрішньоклітинні процеси, що контролюються гормоном, пов’язують з системою cAMP-залежної ПКА, а також ПКС. Крім цих кіназ, кортикотропін викликає швидку активацію протеїнкіназ, що активуються мітогенами (МАР) – ERK1/2 і JNK в клітинах Y1, отриманих з адренокортикальної пухлини мишей. Трактування таких даних потребує уваги щодо пухлинного походження клітин лінії Y1, на яких здебільшого проводили дослідження дії АКТГ на систему МАР-кіназ, – регуляція функції і поділу цих клітин може суттєво відрізнятись від процесів у нормальних клітинах. Тому метою наступного етапу роботи було з’ясування участі МАР-кіназної сигнальної системи, а також факторів транскрипції c-jun та c-fos в трансдукції регуляторного сигналу АКТГ in vivo в корі надниркових залоз щурів. Досліди проведені на тлі істотного збільшення синтезу сумарних 11-гідроксикортикостероїдів (11-ОКС) корою надниркових залоз після введення щурам кортикотропіну в дозі 2 од./100 г маси тіла. Через 1 год після введення АКТГ рівень сумарних 11-ОКС у плазмі крові збільшувався з 1824±156 нмоль/л в контролі до 3220±168 нмоль/л (р<0,05). Через 6 год після введення АКТГ рівень 11-ОКС збільшився в порівнянні з контролем в 3,2 рази і становив 5845±489 нмоль/л в плазмі крові тварин (р<0,01).
Згідно одержаних даних, через 1 год після введення щурам АКТГ вміст ERK1/2 в адренокортикальній тканині зростає в 1,6 рази, а через 6 год починає знижуватись. За даними літератури проліферативна дія кортикотропіну реалізується в клітинах кори надниркових залоз в першу чергу за рахунок активації ERK1/2 кіназ (р42/44), які відносяться до родини серин/треонінових протеїнкіназ, що активуються мітогенами. До родини МАР-кіназ відносять також JNK (c-JunNH2-термінальна кіназа або SAPK – протеїнкіназа, що активується стресом) та р38 кіназу. Ці серин/треонінові кінази в свою чергу є активаторами транскрипційних факторів, які регулюють експресію генів ферментів стероїдогенезу. За отриманими нами даними, найвиразніший вплив АКТГ чинить на рівень JNK кінази. Через 1 год після введення АКТГ її вміст зростає більш ніж вдвічі, через 6 год вірогідно знижується, проте залишається істотно вищим, ніж у контролі (рис. 3). На клітинах Y1 показали, що АКТГ здатний індукувати швидке зростання активності ERK1/2 та стимулювати входження клітин у S-фазу клітинного циклу [Forti, 2006; Lotfi, Armelin, 1998]. Важливим елементом трансдукції та ампліфікації різних регуляторних сигналів в ядрі є транскрипційний фактор АР-1, який складається з двох субодиниць, транскрипційних факторів с-jun і с-fos. Вміст білка с-jun в адренокортикальній тканині зростає майже в 1,7 рази через 1 год після введення АКТГ (рис. 3). Звертає на себе увагу значне збільшення з часом вмісту білка с-fos, який вірогідно зростає в 1,7 рази тільки через 6 год після введення кортикотропіну.