Активність Na+,K+-АТPази (АТР: фосфогідролаза 3.6.1.3)визначали за утворенням неорганічного фосфату як різницю між сумарною активністю АТРаз та активністю Ca2+,Mg2+-АТФази (у присутності 0,1 мМ уабаїну) (Rathbun P.J., 1969).
Про активність полі-ADP-рибозополімерази (NAD+: полі(аденін-дифосфат-D-рибозил)-акцептор-ADP-D-рибозилтрансфераза 2.4.2.30) судили за кількістю радіоактивно мічених ADP-рибозильних фрагментів NAD+, включених до загальних ядерних білків клітин головного мозку щурів, за методом Tanigawa Y. et al., 1977. Рівень базального та індукованого холерним токсином (2 мкг преактивованого у 20 мМ дитіотрейтолі токсину на 1 мг білка синаптосом) моно-ADP-рибозилювання синаптосомальних білків оцінювали за включенням [U-14C]ADP-рибозильних фрагментів NAD+ до синаптосомальних білків (Qian Z. et al., 1983).
Інтенсивність процесів ПОЛ оцінювали за рівнем дієнових кон’югатів (Тимирбулатов Р.А., 1983) та ТБК-активних продуктів (Тимирбулатов Р.А., 1981). При визначенні вмісту дієнових кон’югатів у гомогенаті мозку, їх екстрагували у гептан-ізопропаноловій суміші та вимірювали оптичну густину гептанового шару (l = 233). Вміст ТБК-активних продуктів визначали спектрофотометрично за їх реакцією з тіобарбітуровою кислотою. Ступінь пошкодження ДНК визначали спектрофотометрично за (Ходарев Н.Н. и др., 1981).
Результати досліджень оброблялись статистично з використанням t-критерію Стьюдента.
Результати досліджень та їх обговорення
1. Молекулярні механізми нейромодуляторної дії NAD+ у нервових закінченнях. Мембранні системи пасивного та активного іонного транспорту, визначаючи проникність мембрани для іонів за деполяризації як необхідної передумови нейросекреції, можуть бути залучені до механізму NAD-індукованого вивільнення медіаторів. З огляду на це досліджували роль потенціалкерованих Na-каналів та Na+,K+-АТPази синаптичних мембран у прояві нейромодуляторних ефектів NAD+, використовуючи нейротоксини, дія яких на канальні структури збудливих мембран добре відома, а також інгібітор Na+,K+-АТPази – уабаїн.
Рис. 1. Вивільнення [2-14С]серотоніну синаптосомами головного мозку щурів при дії нейротоксинів та NAD+ (1мкМ), M±m, n=5-7; Примітка: абсолютну величину вивільнення в контролі (К) – 17,3 ± 0,85 пмоль/0,2 мг білка прийнято за 100 ± 4,3 %
Показано, що при внесенні у середовище інкубування синаптосом головного мозку щурів тетродотоксину (ТТХ) - специфічного блокатору потенціалчутливих Na-каналів - вивільнення [2-14C]серотоніну синаптосомами під дією NAD+ (1 мкМ) суттєво знижувалось (рис. 1). Блокувальний ефект ТТХ на NAD-індуковане
вивільнення медіатору свідчить про активацію саме потенціалчутливих Na-каналів у механізмі реалізації нейромодуляторних ефектів NAD+. На тлі дії активатору Na-каналів вератридину (VTD) або латротоксину (LTX, формує канали з широкою селективністю до одно та двохвалентних катіонів), які стимулювали вивільнення серотоніну на 70 та 120 % відповідно, істотні ефекти NAD+ відсутні (рис. 1). Вірогідно, модифікація під впливом досліджуваних токсинів канальних іонотранспортувальних структур призводить до швидкого виснаження екзосекреторної активності синаптосом, внаслідок чого NAD+ не спроможний додатково стимулювати процес вивільнення нейромедіатору.
Рис. 2. Вплив invitroNAD+ та нікотинаміду (10-3,10-5,10-6 М) на мембранний потенціал (а) синаптичних закінчень мозку щурів (К – контроль; А – аденозин, 10-6 М; ● - NAm; □ – NAD+) та вивільнення [2-14С]серотоніну синаптосомами (б, контроль - 100%), M±m, n=5
Це не виключає залучення пулу готових до вивільнення везикул у механізмі NAD-залежного вивільнення серотоніну. Внесення в інкубаційне середовище уабаїну призводило до 24 %-го підвищення рівня вивільнення [2-14С]серотоніну у порівнянні зі спонтанним. Додавання NAD+ у кількості, необхідній для створення його кінцевої концентрації 10-6 М, сприяло подальшому підвищенню вивільнення медіатору. Очевидно уабаїн, викликаючи помірну деполяризацію синаптичних мебран, залучає лише певну частину пулу готових до вивільнення везикул в даному активному секреторному процесі, що дозволяє динуклеотиду надалі стимулювати вивільнення нейромедіатору за механізмом екзоцитозу.
Дослідження залежності гідролізу АТР синаптосомальною Na+,K+-АТPазою від концентрації субстрату при одночасній дії NAD+ (1 мкМ) продемонструвало гальмівний ефект динуклеотиду на активність цього ферменту. Установлене інгібування відноситься до типу неконкурентного, адже воно не послаблювалось при підвищенні концентрації субстрату (1000-кратний надлишок). Показано також, що динуклеотид концентраційнозалежно (1 мМ – 0,1 мкМ) знижує активність Na+,K+-АТPази синаптосом, тоді як на рівні синаптичних мембран лише експозиція 1 мМ NAD+ призводить до 25 % інгібування активності. Одержані результати вказують на важливість субмембранних компонентів, які на відміну від очищених мембран може містити фракція синаптосом, для механізму NAD-індукованого гальмування активності Na+,K+-АТРази, що не виключає можливості опосередкованої модифікації Na+,K+-помпи певними протеїнкіназами функціонально асоційованими з NAD-зв’язувальним білком. Згідно з отриманими нами даними нейромодуляторна дія динуклеотиду, імовірно, може реалізуватись через активацію фосфорилювання ефекторних білків синаптичних закінчень під дією протеїнкінази С/А, з огляду на здатність Н7, інгібітору цих кіназ, блокувати ефекти NAD+ на вивільнення серотоніну.
Таблиця. Вміст нуклеотидів у головному мозку за діабетичної невропатії: ефект двохтижневого введення нікотинаміду та нікотиноїл-ГАМК, мкмоль на 1 г тканини (M ± m, n=6-8)
Передбачається, що нікотинамід може конкурувати за місця специфічного зв’язування NAD+ на синаптичних мембранах мозку щурів. Проте на сьогодні нема чіткої відповіді, яким є характер його нейромодуляторної дії in vitro. У зв’язку з цим у порівняльному аспекті вивчали ефекти NAD+ та NAm у синаптичних закінченнях з метою оцінки можливості залучення NAD+-зв’язувального білка синаптичних мембран до механізму реалізації нейротропної дії вітаміну РР. Як виявилось, ефекти NAm (0,001-1 мМ) на мембранний потенціал та вивільнення серотоніну є значно менш вираженими ніж при внесенні відповідних концентрацій NAD+ (рис. 2). Недостатня ефективність NAm у проведеному порівняльному дослідженні свідчить про те, що його нейротропна дія як попередника біосинтезу NAD+ можливо опосередкується нейромодуляторними ефектами динуклеотиду через NAD-зв’язувальний білок.
2. Специфічне зв’язування [U-14C]NAD+ синаптичними мембранами при цукровому діабеті 1 типу та за умов інтенсифікації біосинтезу NAD+. У ході роботи важливо було з’ясувати ті функціональні та біохімічні порушення у ЦНС, які можуть впливати на NAD-модуляторну систему за цукрового діабету 1 типу. Подібно до зниження внутрішньоклітинного вмісту нікотинамідних динуклеотидів як спільної патобіохімічної ознаки багатьох захворювань нервової системи [MaieseK. ChongZ.Z., 2003; SkaperS.D., 2003], за діабету також виявлено зниження рівня NAD+ у головному мозку (на 30 %), таблиця. Очевидно, що дефіцит NAD+ не пов’язаний з посиленням фосфорилювання динуклеотиду, так як вміст NADP+ був також знижений на 23 %. Установлені за ЦД1 зміни у забезпеченості мозку нікотинамідними динуклеотидами можна цілком
Рис. 3. Активність полі-ADP-рибозополімерази у ядрах клітин головного мозку щурів за введення нікотинаміду та N-ГАМК (мкмоль інкорпорованої [U-14C]ADP-рибози*10-5/хв на мг білка, M±m, n = 8-10)
пояснити виявленим посиленим використанням NAD+ як субстрату у процесах полі-АDP-рибозилювання ядерних білків в ході репарації ДНК. Продемонстровано більш ніж 20 % підвищення активності ядерної полі-АDP-рибозополімерази за діабету у порівнянні з контролем (рис. 3). Це відбувається одночасно з інтенсифікацією вільнорадикальних процесів у ЦНС, про що свідчить акумулювання у мозку первинних та кінцевих продуктів ліпопероксидації - відповідно дієнових кон’югатів (не наведено) та ТБК-активних продуктів (рис. 4). Не виключено, що одним з фізіологічно небезпечних наслідків виснаження внутрішньоклітинного пулу NAD+, обумовленого інтенсифікацією NAD-залежного полі-ADP-рибозилювання ядерних білків, можна вважати паралельно встановлену за діабету нестачу ATP у мозку (таблиця).
Як видно з результатів дослідження, представлених на рис. 5 та 6, на тлі зниженого вмісту NAD+ за діабету має місце істотне, на 51 %, підвищення його специфічного зв’язування синаптичними мембранами у порівнянні з контролем, що здійснюється за рахунок підвищення кількості місць зв’язування NAD+ без зміни спорідненості білка-рецептора до нуклеотиду. Величина високоафінної компоненти зв’язування у контролі становить Кд = 0,33 мкМ (рис. 5).
Рис. 4. Вміст ТБК-активних продуктів у гомогенатах головного мозку щурів за введення нікотинаміду
Для оцінки залежності рецепції NAD+ від забезпеченості мозку нікотинамідними нуклеотидами у порівняльному аспекті досліджували короткотривалі (6 годин – час, за який досягається максимум біосинтезу динуклеотидів) та довготривалі (2 тижні) ефекти низької (20 мг/кг маси тіла) та високої (200 мг/кг) доз NAm та N-ГАМК за ЦД1. З’ясовано, що досліджувані сполуки у використаних дозах як за короткотривалого, так і за довготривалого введення приблизно однаково ефективно впливали на вміст NAD+, фактично повертаючи його до рівня контролю. Однак, прямої залежності між вмістом NAD+ та його рецепцією синаптичними мембранами за різної забезпеченості нервової системи цим динуклеотидом ми не виявили. Отримані результати засвідчили відсутність будь-яких суттєвих ефектів сполук у досліджуваних дозах на зв’язування NAD+ синаптичними мембранами за їх короткотривалої дії.Досягнення фармакологічного ефекту вітаміну РР на відновлення рецепції NAD+ потребувало хронічного введення його високих доз (рис. 6), що поряд з можливістю безпосередньої взаємодії NAm з NAD-зв’язувальним білком, фактично свідчить про залучення механізмів більш опосередкованої та віддаленої у часі дії вітаміну на нейрохімічні процеси у нервових клітинах, які можуть бути пов’язані зі встановленими антиоксидантними властивостями NAm та N-ГАМК (рис. 4), а також з їх роллю як інгібіторів полі-АDР-рибозилювання білків (рис. 3).