Практичне значення одержаних результатів. На підставі проведених морфологічних досліджень удосконалено діагностику медулобластом мозочка, а також принцип розподілу хворих на групи високого та стандартного ризику. В основу цього розподілу покладено комплекс морфологічних та клінічних ознак: група стандартного ризику – Т1-Т3а, М0 стадії за класифікацією Chang, повне або майже повне видалення пухлини, апоптозний індекс нижчий або рівний 1,5%, І або ІІ цитоморфологічний тип; група високого ризику – Т3b-Т4 стадії за класифікацією Chang, наявність мікро- та макрометастазів на момент першої операції, субтотальний або частковий об’єм хірургічного видалення, апоптозний індекс більший за 1,5%, наявність ІІІ цитоморфологічного типу.
Конкретизовані морфологічні діагностичні та прогностичні критерії різних типів медулобластом, що покращить їх діагностику і дасть можливість в клініці реалізувати диференційовані підходи до комплексного лікування цих новоутворень та індивідуалізувати його схеми.
Цитологічні та цитогенетичні дослідження та розроблені за матеріалами дисертації критерії розподілу МБ за цитоморфологічними типами впроваджено в практику роботи відділу нейропатоморфології Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто обґрунтовано актуальність проведеного дослідження, сформульовані мета і завдання роботи, здійснено аналіз наукової літератури та встановлено об’єм дослідження, згідно з яким проведений відбір тематичних історій хвороби. Автором самостійно опрацьовані методики дослідження, особисто виконано весь обсяг цитоморфологічних і цитогенетичних досліджень різних типів МБ мозочка, проведено аналіз результатів гістологічного та імуногістохімічного дослідження, статистичне опрацювання матеріалу та узагальнення одержаних даних.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на III-му з’їзді нейрохірургів України (Алушта, Крим, 2003 р.), конференції нейрохірургів: Нові технології в нейрохірургії (Ужгород, 2006 р.), ХІ-му з’їзді онкологів України (Судак, АР Крим, 2006 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження професора Н.М. Шінкермана (Чернівці, 2007 р.), представлена стендова доповідь на Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю: Молекулярні основи і клінічні проблеми резистентності до лікарських засобів (Київ, 2006 р.).
Апробація дисертації відбулась на розширеному засідання вченої ради Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України сумісно з кафедрами нейрохірургії НМАПО ім. П.Л. Шупика та НМУ імені О.О. Богомольця.
Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 наукових праць, з них 3 статті у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України (в т.ч. 1 одноосібна).
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів, двох розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел та додатку зі списком пацієнтів. Основний текст дисертації викладено на 123 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 17 таблицями та 62 рисунком. Бібліографічний перелік містить 342 джерела, з них 95 кирилицею та 247 латиною.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи дослідження. Для вирішення поставлених у роботі завдань були проведені морфологічні дослідження зразків пухлинної тканини у співставленні з клінічними даними 136 пацієнтів, які були прооперовані в Інституті нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України з приводу МБ мозочка з 2000 по 2006 р. У тому числі були включені 11 пацієнтів, які перенесли першу операцію раніше, але в цей період поступили повторно у зв’язку з продовженим ростом пухлини чи появою метастазів. Серед пацієнтів – 86 чоловіків та 50 жінок (співвідношення чоловіків та жінок 1,72 : 1); 97 – у віці від 7 місяців до 17 років (71,3%) та 39 пацієнтів 18-48 років (28,7%). В 97 випадках пухлина локалізувалась в задній черепній ямці по середній лінії (черв’як мозочка, ІV шлуночок), в 39 випадках – вона розташовувалась виключно в одній з півкуль мозочку.
Аналіз клінічних та інструментально-лабораторних показників проводився на підставі записів в медичній документації (історія хвороби та амбулаторна карта пацієнта). Для топографо-анатомічної характеристики росту МБ використовувалась загальновживана в нейроонкологічній практиці класифікація за Chang (1969).
Матеріал біопсій для гістологічного та імуногістохімічного дослідження відразу після доставки фіксувався у нейтральному формаліні. Отримані з парафінових блоків мікротомні зрізи товщиною
5-8 мкм переносились на предметні скельця та фарбувались. Загальна гістоархітектоніка пухлини оцінювалась за оглядовими препаратами забарвленими гематоксиліном та еозином. Відповідно до гістобіологічної класифікації (Б.С. Хомінський, 1962; Ю.П. Зозуля, Т.П. Верхоглядова, М.І. Шамаєв, Т.А. Малишева, 2000) виділяли: МБ “класичної” структури, десмопластичні МБ, МБ з гліальним диференціюванням, МБ з епендимарним диференціюванням, МБ з нейрональним диференціюванням, дрібноклітинні малодиференційовані МБ.
Використовувались наступні спеціальні методи фарбування: забарвлення гематоксиліном та пікрофуксіном (за Ван-Гізоном), сріблення за Гоморі, забарвлення тіоніном за Нісселем. Визначення проліферативної активності пухлинних клітин здійснювалось шляхом виявлення нуклеопротеїну Кі-67 непрямим імуногістохімічним пероксидазним (DAB) методом.
Для цитологічного та цитогенетичного дослідження готувалися препарати-відбитки пухлинної тканини з нефіксованого біоптичного матеріалу. Цитологічні препарати фарбувались за Папенгеймом і паралельно гематоксиліном та еозином. Для виявлення ядерцевих організаторів та клітин в стані апоптозу використовувався метод сріблення за Хоуел-Блеком з додатковим електронно-мікроскопічним дослідженням ультраструктурних особливостей клітин визначених цитоморфологічних типів.
Для кількісної оцінки структурних ознак використовувався апаратно-програмний комплекс для морфологічних досліджень клітин у складі: мікроскоп біологічний, цифрова камера та програмний модуль для обробки і аналізу цифрових зображень клітин виробництва фірми “LeicaMicrosystemsCMSGmbH”, (Німеччина). Дослідження проводилось в 20 репрезентативних полях зору зі стандартною вимірною рамкою при збільшенні 400. Індекс мічення (ІМ) Кі-67 розраховувався як відношення числа позитивно забарвлених ядер на 100 клітин. Апоптозний індекс (АІ) визначався шляхом підрахунку кількості апоптозних тілець та його еквівалентів на 1000 клітин препарату-відбитка срібленого за методом Хоуел-Блека (20 полів зору по 50 клітин). При аналізі ядерцевих організаторів, відповідно до класифікації П.В. Челідзе, О.В. Зацепіна (1988), підраховувались всі зерна срібла, які окремо розпізнавались, як в самих ядерцях, так і в ядрах в 400 клітинах кожного препарату (10 полів зору по 40 клітин),
Статистична обробка проводилась з використанням пакета програм Statistica 5.0.
Результати досліджень. В результаті вивчення топографо-анатомічних характеристик росту МБ мозочка було встановлено, що як у дітей, так і у дорослих, ці пухлини характеризуються інвазивним поширенням. Частка Т3-Т4 стадій за Сhang (1969) становила 92,8%, інфільтрація дна IV шлуночка спостерігалася у 40,5% випадків МБ черв’яка мозочка у дітей та у 66,6% у дорослих пацієнтів. У дитячому віці відмічалось більш поверхневе розташування пухлини у порожнині IV шлуночка з ростом по поверхні епендимарного покриву з наступним розповсюдженням у ділянку центрального каналу, у дорослих пацієнтів спостерігалась більш виразна інфільтрація дна IV шлуночка та частіше мало місце поширення пухлини на вентральну поверхню стовбуру мозку – 15,4%, що майже в два рази перевищує подібні показники у дітей.
Ми встановили, що розподіл МБ за структурними підтипами відрізнявся в різних вікових групах. Виявилось, що у пацієнтів 18-48 років, МБ “класичної” будови значно переважали над іншими підтипами цих пухлин та становили 61,5% від усіх спостережень в цій групі, частка пухлин цього підтипу у пацієнтів віком до 18 років – 33%. Дрібноклітинні малодиференційовані МБ становили другий за чисельністю підтип МБ, як у дорослих, так як і у пацієнтів дитячого віку (12,8% та 25,7% відповідно). Пухлини з варіантами епендимарного та гліального диференціювання у дорослих зустрічались нечасто (7,7% та 2,6% відповідно). На відміну, у дітей ці підтипи були представлені серед більшого числа спостережень (17,5% та 12,4%). Виключення становили лише випадки МБ із здатністю до нейронального визрівання – у старших пацієнтів вони зустрічались частіше (7,7%), чим у дітей (2,1%). Тобто, з перерахованого можна зробити висновки, що тенденція до клітинного диференціювання виразніша в молодшому віці.
Медулобластоми, як відомо, виявляють тенденцію до субарахноідальної дисемінації пухлинних елементів з формуванням імплантаційних метастазів. На момент первинної діагностики дисемінація процесу підтверджується у 22,1% усіх випадків (це 23,7% пацієнтів до 18 років та 18% – дорослих).
У різні строки після першої операції у 30,1% від усіх спостережень виявлялись ознаки продовженого росту МБ та/чи метастатичне ураження (24,7% серед випадків дитячих МБ та 42,6% з групи дорослих пацієнтів). Час від першої операції до моменту виявлення продовженого росту та/чи метастазів у дітей становив від 2,5 місяців до 3,5 років (M±m 16,9±2,3 місяці), а у дорослих пацієнтів від 6 місяців до 14 років (M±m 42±11,7 місяці) відповідно. У пацієнтів дитячого віку частота метастазування (14,4%) була вище ніж відсоток продовженого росту (11,3%), навпаки, в групі дорослих пацієнтів ризик продовженого росту пухлини (38%) значно переважає над часткою метастатичного ураження (17,2%).
Проведені дослідження морфологічних змін у пухлинній тканині метастазів МБ та при продовженому рості, порівняно з матеріалом первинних пухлин, дали змогу виявити певні чіткі закономірності. Насамперед це стосується трансформації типової гістоархітектоніки, внаслідок чого зменшується кількість патогномонічних для МБ “класичної” структури псевдорозеток Хомера-Райта та колонарних структур, вони стають менш чіткими, “змазаними”. Розташування пухлинних елементів втрачає свою періодичність та відносну рівномірність, характерну для первинних МБ, замість цього визначаються вогнищеві густоклітинні скупчення, які межують з більш пухкими ділянками, серед яких розсіяні окремі злоякісні клітини. Вказані зміни виявлялись не лише в “класичних” МБ. В усіх варіантах, які в тій чи іншій мірі були здатні до різних типів клітинного диференціювання, виникала певна тенденція до зменшення ступеня “зрілості”, тобто гістотип МБ, в умовах рецидиву хвороби, наближався до дрібноклітинного малодиференційованого. Такі зміни ми вважаємо специфічними проявами пухлинної прогресії, на відміну від інших знахідок, як то – вогнища некрозів з появою багатоядерних клітин, сполучнотканинна активація у оболонах мозку, дегенеративні зміни стінок судин з проявами порушення мікроциркуляції. Останні можуть свідчити як про реактивні процеси в тканинах прилеглих до зони інвазії, так і у випадках продовженого росту можуть бути наслідком впливу променевої терапії.