Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на X Конгресі Світової федерації Українських лікарських товариств (м.Чернівці, 26-28 серпня 2004 р.), Ювілейному З’їзді Всеукраїнського лікарського товариства (Івано Франківськ, 21-22 квітня 2005 р.), Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів» (Тернопіль, 30-31 травня 2006 р.), ІV Міжнародній науково-практичній конференції «Актуальні питання гігієни харчування та безпечності харчових продуктів. Міжнародні, європейські і національні підходи до вирішення. Нові критерії оцінки ризику, показники, методи та регламенти. Питна вода – харчовий продукт №1. Проблеми функціонального харчування» (Київ, 25-26 жовтня 2006 р.), ІV Національному конгресі АГЕТ України (Сімферополь – Алушта, 21 – 23 вересня 2006р.).
Публікації. За темою дисертації автором отримано патент України на винахід, опубліковано 11 наукових робіт, з них 7 – у фахових журналах, 4 – у матеріалах з’їздів і конференцій, з них 7 наукових праць опубліковано за одноосібною участю автора.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація написана українською мовою на 148 сторінках друкованого тексту у традиційному стилі, з яких 123 сторінки залікового принтерного тексту, і складається із вступу та розділів: огляд літератури, матеріали і методи дослідження, трьох розділів викладених результатів досліджень, аналізу результатів дослідження, висновків, а також списку використаних джерел. Список літератури містить 145 джерел літератури, у тому числі 60 іноземних. Дисертація ілюстрована 41 мікрофотографією, 5 діаграмами та 11 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали та методи досліджень. Дослідження проводилося на гіпертензивних щурах лінії SHR та нормотензивних щурах лінії WKO, що використовувалися в якості контрольної групи. В експерименті було використано п’ятдесят щурів.
Для виконання експерименту тварини було доставлено з розплідника „Пущіно” (Росія), науково-виробничого підрозділу Філіала Інституту біоорганічної хімії ім. Акад. М.М.Шемякина та Ю.А. Овчинникова і має найвищу міжнародну SPF-категорію.
Розподіл тварин на групи було зроблено відповідно до завдань дослідження. В залежності від виду експерименту тварин було поділено на 4 серії.
В першій серії проведене морфометричне, мікроскопічне та електронномікорскопічне дослідження печінки, підшлункової залози та тонкої кишки у гіпертензивних та нормотензивних щурів.
В другій серії визначалася морфологічна реакція печінки, підшлункової залози та тонкої кишки при есенціальній гіпертензії на застосування дієти з біологічно активною добавкою „Енергетин”.
Біологічно активна добавка (БАД) „Енергетин” є сумішшю меду з пряноароматичними рослинними компонентами, які стимулюють гастроінтестінальні рецептори дуоденуму і викликають мобілізацію регуляторних систем, стимулюючи процеси травлення (патент України на винахід № 38648 від 15.01.2004 р.).
В третій серії вивчалася жовчовидільна та жовчоутворювальна функція печінки за умов есенціальної гіпертензії та нормотонії,а також біохімічні показники крові: АлАТ, малоновий диальдегід (МДА), активність супероксиддисмутази (СОД), активність церулоплазміну (ЦП), концентрація відновленого глутатіону (SH-групи), активність каталази, рівень ендогенної інтоксикації (ЕІ), концентрація сукцинатдегідрогенази (СДГ), концентрація холестерину (ХС), вміст заліза, кальцію, фосфору в сироватці крові.
У четвертій серії досліджувався вплив коригувальної дієти з БАД „Енергетин” на жовчовидільну та жовчоутворювальну функцію печінки при есенціальній гіпертензії, а також на динаміку біохімічних показників. Окрім цього визначався систолічний артеріальний тиск.
При проведенні мікроскопічного дослідження фрагменти досліджуємих органів фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, промивали проточною водою, дегідратували у спиртах зростаючої концентрації та занурювали у парафін. На санному мікротомі виготовлялися зрізи товщиною 5-7 мкм і забарвлювали гематоксиліном та еозином. На монітор комп’ютера зображення виводили з мікроскопу ЛОМО Биолам И за допомогою відеокамери VisionCCDCameraі програми InterVideoWinDVR.
Морфометричні дослідження проводилися за допомогою програм Видео Тест - 5.0, КААРА ImageBase та MicrosoftExel на персональному комп’ютері. Зображення зберігали на вінчестері з наступним друком ілюстрацій.
Програма органо- та морфометрії передбачає - в печінці: визначення відносної маси печінки (%), об’єму ушкоджених гепатоцитів (%), ядерно-цитоплазматичного співвідношення, кількості двоядерних гепатоцитів (Na), об’єму некрозів в паренхімі печінки (Vv), об’єму дистрофічних змін в гепатоцитах (Vv), об’єму склерозування портальних трактів (Vv); в підшлунковій залозі - визначення площі зрізу ацинуса (мк2), площі, зайнятої ацинозними клітинами (мк2), площі просвіту ацинуса (мк2), числа клітин в одному ацинусі, числа ядер в одній клітині (екзокриноцити), площі острівцевої клітини (мк2), площі цитоплазми острівцевої клітини (мк2), площі ядра острівцевої клітини (мк2); в тонкій кишці - висоти епітеліоцитів з обплямівкою (мк), товщини власної пластинки слизової у ворсинках (мк), товщини слизової оболонки (мк).
При проведенні електронномікроскопічного дослідження тканину органів розміром 1 мм2 занурювали в 1% забуферений розчин чотириокису осмію при температурі 40 С. Після фіксації тканину промивали у буферному розчині Міллоніга і проводили дегідратацію в спиртах зростаючої концентрації та ацетоні. Потім її укладали в суміш епоксидних смол за загальноприйнятою методикою. Ультратонкі зрізи одержували на ультрамікротомі УТПМ-7, контрастували цитратом свинцю і переглядали на електронному мікроскопі ЕМ-125К та ЕМ-100Л.
Вимірювання артеріального тиску проводилося шляхом накладання модифікованої манжети, сполученої зі стандартним манометром, на основу хвоста. Першу пульсову хвилю фіксували реографічним методом. Дослідження жовчовиділення проводили за методикою М.П. Скакуна і А.М. Олійник (1968). За методикою Мірошниченко В.П. і співавт. (1978) визначали концентрацію сумарних жовчевих кислот і холестерину, а загального, прямого і непрямого білірубіну в жовчі, за методом, описаним у роботі М.П. Скакуна (1967).
Статистичну обробку числових даних проводили на персональному комп’ютері з використанням стандартного пакету прикладних програм MicrosoftOffice. Статистичний аналіз виконували відповідно до алгоритмів, наведениху літературі (Автанділов Т.Г. 1990, Лакин Г.Ф., !990). При встановленні достовірності відмінностей між досліджуваними показниками застосовували непараметричний U-критерій Уілкоксона Манна-Уітні. Відмінності вважали достовірними при вірогідності альтернативної гіпотези не менше як 95% (р£0,05).
Результати дослідження та їх обговорення. При морфометричних дослідженнях печінки у щурів лінії SHR ми спостерігали зростання об’єму некрозів клітин – на 99,5% та кількості двоядерних гепатоцитів на 50,1%, яке можна трактувати як компенсаторний регенераторний процес.
В деяких ділянках деструктивно-дегенеративні зміни завершуються коагуляційним некрозом, причому загиблі гепатоцити не виштовхуються в синусоїдальні простори, а локалізуються в печінковій пластинці. Дані патологічні явища переважають в периферичній ділянці печінкової часточки. Більшість зірчастих ретикулоендотеліоцитів скупчуєтья навколо портальних трактів, а також у великій кількості локалізується в стінках синусоїдів, що свідчить про інтенсифікацію деструктивнодегенеративних процесів, показник яких зростає більш ніж в 2,5 рази.
Виявлену помірну білкову (зернисту) дистрофію у щурів із есенціальною гіпертензією в центролобулярних гепатоцитах можна пояснити, як результат розширення центральних вен та синусоїдальних просторів, внаслідок гемодинамічних та циркуляторних змін, зростання вутріпортального тиску, явищ набряку, стазу, або ж метаболічних порушень, зокрема, надмірного утворення оксидативних білків при інтенсифікації вільнорадикальних процесів та їх розщепленню протеїназами (Самохіна Л.М., Коваль С.М., 2004).
В гіпертензивних тварин показник дистрофічних змін зростає більш ніж у 6 разів, що вплинуло на об’єм склерозування портальних трактів, який збільшувався у 4 рази в порівнянні із контролем за рахунок, в основному, зростання кількості колагенових волокон.
Склерозування портальних трактів, очевидно, зумовлено гіпоксією, яка виникає внаслідок застійних та мікроциркуляторних порушень. Ядерно-цитоплазатмачний індекс у гіпертензивних тварин також зростає і становить 0,6, на відміну від нормотензивних, де він становив 0,5, що вказує на набряк ядра, імовірно, внаслідок дефіциту енергії та зниження активності іонних енергозалежних помп.
Дані про негативну динаміку процесів енергетичного метаболізму підтвердилися нашими електронномікроскопічними дослідженнями: у цитоплазмі гепатоцитів органели розміщені нерівномірно й мають ознаки деструкції, канальці гранулярної ендоплазматичної сітки нерівномірно потовщені. На поверхні мембран у цитоплазмі мало рибосом як і полісом. Диктіосоми комплексу Гольджі невеликі та мають розширені ділянки цистерн і вакуолей. Мітохондрії мають подовгасту або округлу форму, світлий матрикс і часково збережені крипти, проте у деяких мітохондрій повністю відсутні крипти та внутрішня мембрана. Такий стан органел свідчить про порушення обмінних процесів і зниження їх енергетичного забезпечення.
Наявні розширені кровонаповнені синусоїдні гемокапіляри, стінку яких утворюють ендотеліоцити, що мають плоску витягнуту форму. На низьку функціональну активність ендотеліальних клітин вказує потовщення ядерної зони, та цитоплазма з електронно-світлою гіалоплазмою, в якій мало органел. При такому стані судин мікроциркуляторного русла погіршуються процеси транскапілярного обміну.