Федеральное агентство по образованию
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Реферат на тему:
Постановка реакции ПЦР
Челябинск 2008
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
1. Устройство, задачи и функции лаборатории иммунологического типирования тканей2. Выделение ДНК из венозной крови3. Проведение ПЦР4. Ход реакции5. Анализ ПЦР-амплифицированной ДНКЗаключениеВВЕДЕНИЕ
В начале 1970-х годов норвежскому ученому Къеллу Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Хораны (Har Gobind Khorana) пришла в голову мысль, что можно амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК - синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кери Маллисом (Kary Mullis). Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.
ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах. ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику наследственных и вирусных заболеваний, используется для подбора гистосовместимого донора органов и тканей, регистрации всех потенциальных реципиентов, нуждающихся в тканевых и органных трансплантантах, проведения иммунологического контроля за приживлением пересаженных органов и тканей.
Перед выделением ДНК необходимо приготовить рабочий раствор солевого буфера. Для этого Содержимое флакона с 10-кратным Солевым буфером, 10 мл, перенести в мерный цилиндр, довести бидистиллированной водой до метки 100 мл и 96% этиловым спиртом довести до метки 300 мл и перемешать. Готовый рабочий раствор Солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4˚С. Солевой буфер необходим для дальнейшей промывки осадка с ДНК.
Выделение ДНК проводят в специализированном боксе для выделения. Необходимо соблюдать правила техники безопасности:
- руки должны быть защищены одноразовыми перчатками, которые утилизируются после выделения;
- дыхательные пути защищены одноразовой маской, которая также подлежит утилизации после использования;
- лаборант во время выделения должен быть одет в специальный халат, шапочку и очки.
Все манипуляции с исследуемым материалом проводят при соблюдении правил работы с вирусами III и IV группы. Постановку ПЦР осуществляют как минимум в 3 рабочих зонах:
Зона 1 (ламинарный бокс, бокс с УФ-лампой): подготовка ПЦР-реагентов.
Зона 2 (ламинарный бокс, бокс с УФ-лампой): подготовка проб и контролей, выделение ДНК, внесение проб в пробирки с ПЦР-реагентами, проведение амплификации.
Зона 3: детекция амплифицированной ДНК.
Пробы из зоны 3 запрещено переносить в зоны 1 и 2 во избежание контаминации ДНК-матрицей. Пипетки или наконечники должны иметь аэрозольный барьер. Перчатки и халаты необходимо менять при переходе из одной зоны в другую.
Оборудование, необходимое для выделения ДНК:
– ламинарный бокс или стерилизуемое УФ-излучением помещение;
– одноразовая пластиковая посуда (стерильные пробирки типа "Эппендорф" объемом 1,5; 0,5; 0,2 мл);
– автоматические пипетки объемом от 0,5 мкл до 1 мл;
– сменные одноразовые наконечники с аэрозольными фильтрами;
– центрифуга типа "Эппендорф" с охлаждением и скоростью не менее 10000 g;
– встряхиватель ("Вортекс");
Выделение ДНК из венозной крови проводят в несколько этапов:
1. В пробирку объёмом 1,5 мл внести 300 мкл исследуемой пробы, добавить 800 мкл Лизирующего реагента и перемешать содержимое пробирки переворачиванием (5-10 раз). Интенсивное встряхивание смеси не рекомендуется. Лизирующий реагент необходим для разрушения клеток крови и экстракции из них ДНК.
2. Термостатировать пробирку со смесью 5-7 мин. При температуре 65˚С. Если выделение ДНК проводится из твёрдого сухого мелкоизмельчённого материала, то следует термостатировать 30-40 мин.
3. После термостатирования центрифугировать пробирку со смесью 10 сек при 5000 об. в мин., в том случае, если смесь содержит несолюбилизированный клеточный дебрис или другой нерастворённый осадок. Прозрачный супернатант целиком перенести в чистую пробирку.
4. В пробирку с чистой смесью добавить 45 мкл суспензии сорбента NucleoSTM. Перед использованием NucleoSTMследует интенсивно перемешать до гомогенной суспензии на вортексе. NucleoSTMнеобходим для того, чтобы на его частицах осела выделенная из клеток ДНК.
5. Пробирку поместить на ротатор и перемешивать 10 мин (10-20 об/мин) для лучшего оседания выделенной ДНК на частицах кремния.
6. Центрифугировать 10 сек при 5000 об. в мин.
7. Осторожно, не задевая осадок, удалить супернатант с помощью водоструйного насоса.
8. К осадку добавить 400 мкл Лизирующего реагента, тщательно перемешать на вортексе до полного гомогенного состояния. Если супендирование затруднено (при большой нагрузке ДНК) из-за слипания сорбента, то его необходимо вначале суспендировать наконечником пипетки, а затем на вортексе.
9. Добавить в пробирку 1 мл рабочего раствора Солевого буфера и перемешать содержимое переворачиванием пробирки 5-10 раз.
10. Центрифугировать 10 сек при 5000 об. в мин.
11. Осторожно удалить супернатант, не задевая осадок, с помощью водоструйного насоса.
12. Повторить промывку дважды Для этого необходимо добавлять по 1 мл Солевого буфера, перемешивать содержимое пробирки на вортексе, центрифугировать 10 сек. при 5000 об. в мин. и удалять прозрачный супернатант.
13. Просушить осадок при температуре 65˚С в течение 3-4 мин.
14. В эту же пробирку внести 300 мкл ЭкстраГена ЕТМ, который необходим для отделения промытой ДНК от частиц кремния. ЭкстраГен ЕТМ следует отбирать от общего объёма при постоянном перемешивании.
15. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5-10 сек до получения гомогенной суспензии, затем термостатировать 4-5 мин при 65˚С.
16. Ещё раз суспендировать содержимое пробирки на вортексе перед центрифугированием. Центрифугировать 1 мин при 10000 об. в мин.
17. Перенести супернатант с ДНК в чистую пробирку. ДНК хранить при температуре -20˚С.
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
· ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
· Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента.
· Термостабильная ДНК-полимераза— фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов— Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.