Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.
б) стационарная схема определения активности.
| опыт | контроль |
| 400 мкл субстратного буфера | 600 мкл субстратного буфера |
| 200 мкл сукцината натрияна субстратном буфере | – |
| 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата | 200 мкл 0,02 М феназинметасульфата |
| 200 мкл 0,001 М ДХФИФНЕПОСРЕДСТВЕННОПЕРЕД ОПЫТОМ | 200 мкл 0,001 М ДХФИФНЕПОСРЕДСТВЕННОПЕРЕД ОПЫТОМ |
| Инкубация на водяной бане 3 мин при 37 °С | |
| 3 мл фракции,НАГРЕТОЙ ДО 37 °С | 3 мл фракции,НАГРЕТОЙ ДО 37 °С |
| Инкубация на водяной бане 30 мин при 37°С | |
| 1 мл 1 н HCl | 1 мл 1 н HCl |
Затем пробы переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин про 4000 об/мин. Измеряют оптическую плотность системы на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре при 600 нм. Белок определяют по Лоури. При расчете истинной активности сукцинатдегидрогеназы величины эндогенной активности вычитают из величин, выражающих активность сукцинатдегидрогеназы в пробах, содержащих сукцинат.
Активность выражают в нмолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка, учитывая, что снижение оптической плотности на 1,0 эквивалентно восстановлению 60 нмолей 2,6-ДХФИФ, а количество восстановленного красителя пропорционально количеству окисленного сукцината.
Содержание отчета
1. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы.
| Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С | ||||||
| Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
| Оптическая плотность,в каждой параллели и среднее | ||||||||||||
| Аоп – Акн | ||||||||||||
| Количество сукцината | ||||||||||||
| Активность на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Активность фракции в % от гомогената | 100% | |||||||||||
| Количество белка на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Белок в % от белка гомогената | 100% | |||||||||||
| Относительная удельная активность фракций | ||||||||||||
Работа 14. Изучение субклеточного распределения глюкозо-6-фосфатазы (маркера микросомальной фракции) в животных тканях
Оборудование и реактивы: центрифуга; печень животного; пипетки; 0,1 М цитратный буфер рН 6,5; 0,08 М раствор глюкозо-6-фосфата (Г-6-Ф) в 0,1 М цитратном буфере****; 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); раствор молибдата аммония*; восстанавливающий раствор**; стандартный раствор фосфора (5∙10-5 М)***.
* Приготовление раствора молибдата аммония. 2,5 г молибдата аммония растворяют в 50 мл воды; 14 мл конц. серной кислоты приливают к 200 мл воды. Разбавленную кислоту наливают в раствор молибдата и доводят объем до 1000 мл.
** Приготовление восстанавливающего раствора. К 1,8 г Na2SO3 приливают 11,3 мл 1 н HClи 5 мл воды. Затем растворяют 25 мг 1-амино-2-нафтол-4-сульфокислоты и доводят общий объем до 25 мл. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
*** Приготовление стандартного раствора фосфора. 68 мг КН2РО4 растворяют в 20 мл воды и добавляют 10 мл конц. серной кислоты и доводят объем до 1000 мл.
**** Приготовление раствора Г-6-Ф. 55 мг глюкозо-6-фосфата растворяют в 2 мл 0,1 М цитратного буфера рН 6,5. ГОТОВЯТ В ДЕНЬ ОПЫТА.
Навеску ткани 2 г переносят в стакан гомогенизатора и добавляют 20 мл среды Б, гомогенизируют. Отбирают 2 мл на определение активности фермента и содержания белка в гомогенате. Центрифугирование и отбор фракций для анализа производят по схеме, приведенной в работе № 11.
Активность глюкозо-6-фосфатазы определяют в исходном гомогенате, ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и растворимой клеточной фракции по следующей схеме.
| опыт | контроль 1 | контроль 2 |
| 100 мкл фракции | 100 мкл фракции | 100 мкл буфера |
| Инкубация 10 мин при 37°С | – | – |
| 100 мкл Г-6-Ф | 100 мкл буфера | 100 мкл Г-6-Ф |
| Инкубация 20мин при 37°С | ||
| 2 мл 10 % ТХУ | ||
Центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин. Далее в стеклянных пробирках производят смешение согласно схеме.
| опыт | контроль 1 | контроль 2 | стандарт |
| 1 мл надосадочной жидкости | 1 мл станд. р-ра фосфора | ||
| 5 мл раствора молибдата | |||
Затем в каждую пробирку через промежутки времени, необходимые для дальнейшего колориметрического измерения, приливают по 1 мл восстанавливающего раствора.
Каждую пробу оставляют на 15 мин при комнатной температуре и затем промеряют экстинкцию при 750 нм на ФЭК. Количество белка определяют по Лоури. Активность фермента выражают в ммолях фосфата, отщепленного за 1 мин инкубации на 1 мг белка.
Содержание отчета
1. Обоснуйте наличие в данной методике двух контролей и стандарта.
2. Расчет полученных данных представляют в виде таблицы:
| Фракции | Г | Я | ТМ | ЛМ | Р | С | ||||||
| Анализируемые пробы | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | Оп. Кн. | ||||||
| Оптическая плотность,в каждой параллели и среднее | ||||||||||||
| Аоп – Акн | ||||||||||||
| Количество фосфата | ||||||||||||
| Активность на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Активность фракции в % от гомогената | 100% | |||||||||||
| Количество белка на 1 мг ткани | ||||||||||||
| Белок в % от белка гомогената | 100% | |||||||||||
| Относительная удельная активность фракций | ||||||||||||
Работа 15. Определение глюкозы в крови человека с использованием ферментных электродов
Оборудование и реактивы: свежая кровь (взятая непосредственно перед определением)*, стеклянные капилляры Roche, автоматический анализатор RocheOmniS6**.
*Для работы используется капиллярную кровь из пальца. Палец обработать ватой, смоченной медицинским спиртом, произвести прокол скарификатором с помощью автоматической ручки-прокалывателя. Кровь собирать в стеклянный капилляр Roche.
** Перед работой с прибором внимательно ознакомьтесь с его строением и правилами эксплуатации.
В ферментных электродах фермент и электрод образуют единую конструкцию, не требующую для функционирования дополнительных реагентов, кроме буферных растворов. Такие электроды получили название «безреагентных» датчиков, а основанные на их использовании методы анализа называются «безреагентными». Для определения глюкозы используется фермент глюкозооксидаза, иммобилизованная ковалентным связыванием с полупроницаемой поликарбонатной мембраной. Измерение осуществляется с помощью амперометрии. Операционные характеристики электрода остаются стабильными на протяжении двух-четырех недель.
Проведите измерение трех разных образцов крови. Переведите прибор в режим работы с капиллярной кровью. Снимите верхнюю крышку с анализатора для ознакомления с ходом распределения образца крови во время анализа. Поместите капилляр с образцом в диск-приемник (FillPort). Активируйте всасывание образца. Анализатор автоматически перейдет в режим измерения. Изучите распределение образца крови и прохождение буферных и промывающих растворов. Дождитесь окончания измерения и распечатайте отчет.
Содержание отчета
1. Запишите результаты определений глюкозы в крови.
2. Зарисуйте схемы устройства ферментного электрода и автоматического анализатора.
Работа 16. Определение мочевины в крови человека с использованием ферментных реагентов
Оборудование и реактивы: свежая кровь (взятая непосредственно перед определением)*, стеклянные капилляры Roche, автоматическая пипетка с наконечниками, биохимический анализатор Рефлотрон +.
*Забор крови осуществляется в капилляр, как описано в работе № 14.
** Перед работой с прибором внимательно ознакомьтесь с его строением и правилами эксплуатации.
Биохимический анализатор Рефлотрон предназначен для экспресс-анализа образцов свежей крови и сыворотки человека. Прибор не требует для работы никаких реактивов, кроме тест-полосок для однократного определения исследуемых веществ. Тест-полоска для определения мочевины содержит лиофилизированный фермент уреазу и индикатор в лейко-форме. Образец нагревают, и мочевина, содержащаяся в образце, при 37۫°С расщепляется с образованием аммиака и оксида углерода. Это ведет к частичной смене окраски индикатором на зелено-голубую, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству мочевины в пробе:
(NH2)2CO + H2O = 2 NH3 + CO2
NH3 + индикатор (бесцветный) = NH4+ + индикатор (сине-зеленый).
После 3 минут, необходимых для инкубации образца, измеряется оптическая плотность по принципу рефлексионной фотометрии. На тест-полоске имеется магнитная лента с информацией об анализе. Прибор считывает информацию об анализе и пересчитывает оптическую плотность в концентрацию.
Приготовьте тест-полоску для анализа. Удалите с ее поверхности защитную алюминиевую полоску. Дозатором отмерьте 32 мкл образца и нанесите его в центр зоны аппликации, не касаясь наконечником тест-полоски. Откройте крышку прибора и поместите тест-полоску в анализируемую зону. Закройте крышку. Анализатор автоматически перейдет в режим измерения. Дождитесь окончания измерения и распечатайте отчет.