Сбор и хранение материала, количественное определение 17 – КС по реакции Циммермана
1. Надпочечники
Надпочечники - небольшие парные органы внутренней секреции, расположенные в забрюшинном пространстве над верхними полюсами почек, представляют собой эндокринную железу. Различаются по форме: правый треугольный, а левый в форме – полумесяца. Средний вес одной железы 3,5 – 5 г. Каждый надпочечник состоит из внутреннего мозгового слоя и наружного коркового вещества, каждый из которых является в свою очередь самостоятельной эндокринной железой. Они отличаются друг от друга строением, секрецией различных групп гормонов и происхождением.
Гормоны, продуцируемые в корковом веществе, относятся к кортикостероидам. Сама кора надпочечников морфо–функционально состоит из трех слоев:
клубочковая зона
сетчатая зона
пучковая зона
В клубочковой зоне образуются минералокортикоиды: альдостерон, кортикостерон, дезоксикортикостерон. Они повышают реабсорбцию натрия и выделение калия в почках.
В пучковой зоне образуются глюкокортикоиды: кортизол, кортикостерон.
Глюкокортикоиды оказывают важное действие практически на все процессы обмена веществ. Они стимулируют образование глюкозы из жиров и аминокислот (глюконеогенез), угнетают воспалительные, иммунные и аллергические реакции, уменьшают разрастание соединительной ткани, повышают чувствительность органов чувств и возбудимость нервной системы. В сетчатой зоне производятся половые гормоны – андрогены, являющимися веществами - предшественниками эстрогенов. Их роль: они активны до полового созревания и после созревания половых желез, в том числе влияют на развитие вторичных половых признаков. Клетки мозгового вещества надпочечников вырабатывают катехоламины - адреналин и норадреналин. В состоянии покоя они постоянно выделяют небольшое количество катехоламинов. Под влиянием стрессовой ситуации продукция катехоламинов значительно возрастает. Кроме катехоламинов клетки мозгового слоя надпочечников вырабатывают пептиды, выполняющие регуляторную функцию в ЦНС и ЖКТ. Среди этих веществ: вещество Р, интестинальный вазоактивный пептид, соматостатин, бета – энкефалин.
2. 17 – кетостероиды (17 – КС)
Вызвав биологический эффект, кортикостероиды, подвергаются катаболическим превращениям в печени. При этом происходит окисление боковой цепи, располагающейся в структуре молекулы гормона у 17 – го атома углерода, в результате чего образуются 17 – КС. У женщин 17 – КС имеют надпочечниковое происхождение, у мужчин – 2/3 образуются за счет гормонов коры надпочечников, 1/3 – за счет – стероидов семенников (тестостерона), синтезирующихся в интерстициальных клетках мужских половых желез. Период полураспада тестостерона составляет несколько десятков минут. У взрослых мужчин с мочой экскретируется не более 1% неизмененного тестостерона, что свидетельствует о его распаде в печени до конечных продуктов обмена.
Небольшая часть 17 – КС (около 15%) является метаболитами в реакциях образования глюкокортикоидных гормонов (кортизол, кортизон, 11 –дезоксикортизол). Основную фракцию 17 - КС в моче представляет дегидроэпиандростерон – сульфат и эпиандростерон из надпочечников, а также метаболиты тестостерона (его предшественники и производные – андростендион, андростерон, этиохоланолон, эпиандростерон), образующиеся в яичках. Они выводятся с мочой в качестве продуктов обмена.
Цели исследования 17 – КС в моче:
1.оценка функционального состояния коркового вещества надпочечников
2.диагностика синдрома Кушинга, болезни Аддисона, адреногенитального синдрома, опухоли яичка и яичника.
Подготовка к исследованию: Объяснить пациенту цели исследования. Каких – либо ограничений в диете и режиме питания не требуется, однако пациенту следует избегать чрезмерных физических нагрузок и эмоциональных стрессов во время сбора мочи. Пациенту сообщают, что для анализа используют суточную мочу, и объясняют, как ее собрать. Сотрудники лаборатории и лечащий врач должны знать, принимает ли пациент препараты, которые могут повлиять на результат анализа (в некоторых случаях от их применения необходимо воздержаться).
Процедуры:
Мочу собирают в специальный контейнер в течение 24 часов, при этом первую (утреннюю) порцию мочи сливают, а последнюю сохраняют для анализа. Для поддержания рН 4,0 – 4,5 в контейнер добавляют консервант. Во время всего периода сбора моча хранится в холодильнике на нижней полке. После окончания сбора, тщательно перемешивается, в другой контейнер наливают 100 -200 мл перемешанной мочи и доставляют в лабораторию.
Ход исследования
1.Экстракция. Для экстракции используют несмешивающиеся с водой растворители, в которые переходят экстрагируемые вещества. В целом чем больше в экстрагируемом веществе полярных групп (оксо - , окси - , альдегидных …), тем лучше оно переходит в несмешивающиеся с водой полярные растворители – высшие спирты, этилацетат. Чем меньше полярных групп, тем больше подходят неполярные растворители – гексан, хлороформ. Эфир занимает промежуточное положение. Эффективность экстракции зависит от рН водного раствора и содержания солей. Эффективнее всего экстракция происходит, если первоначально образуется одна фаза, которая затем разделяется на две при добавлении избытка одного из ингредиентов, но такие условия удается подобрать не всегда, значительно чаще просто встряхивают две несмешивающиеся жидкости. Объемы фаз после экстракции очень часто не соответствуют объемам взятых растворов и растворителей, т к вместе с экстрагируемым веществом в другую фазу часто переходит и часть растворителя и наоборот; это очень затрудняет точный отбор аликвоты из какой – либо фазы. Если вещество плохо экстрагируется, часто используют повторную экстракцию тем же растворителем, а затем оба экстракта смешивают. Важно при проведении экстракции следить, чтобы не образовалась стойкая эмульсия, которая мешает разделению фаз. Это зависит от примесей, поэтому нужно встряхивать осторожно, в то же время достаточно энергично, чтобы наступило равновесие. Образованию эмульсии препятствует увеличение образования соли в растворе, эмульсию можно попытаться разделить центрифугированием. Можно проводить экстракцию в делительных воронках, конических колбах или в пробирках с пришлифованными стеклянными или полиэтиленовыми крышками. Если работают с колбами, надо использовать магнитные мешалки. При работе с пробирками их встряхивают вручную или на встряхивателе (шюттель), пробирки удобны тем, что если образуется эмульсия, ее можно разрешить центрифугированием. После экстракции один слой отделяют от другого, обычно значительно легче отсосать верхний слой и количественно перенести его в чистую посуду, чем нижний. Удобно отсасывать пастеровскими пипетками с грушей, перенося верхний слой небольшими порциями, при этом, если по ошибке будет захвачена небольшая порция нижнего слоя, ее легко вернуть на место.
3. Очистка этанола
Абсолютный этанол готовят из 90 – 96 % этилового спирта кипячением с СаО или ВаО на водяной бане с электроподогревом с обратным холодильником до тех пор, пока точка кипения не станет 78,3 С при нормальном барометрическом давлении.
Обнаружение альдегидов: к 5 мл этанола добавляют 0,2 мл раствора калия перманганата, содержащего 200 мг в 1 л (1 : 5000), раствор не должен обесцвечиваться на протяжении 20 минут. Изменение окраски указывает на присутствие альдегидов. Пищевой спирт содержит больше альдегидов, чем гидролизный.
Способы удаления альдегидов:
1. С 2, 4 динитрофинилгидрозином. К 1 л этанола добавить 2 г гидрохлорида 2, 4 динитрофинилгидрозина и 0,5 мл концентрированной соляной кислоты, закрывают пробкой и оставляют стоять 2суток в темноте, затем перегоняют.
2. С нитратом серебра. В 100 мл горячего этанола растворяют 7 г нитрата серебра и добавляют туда 15 г едкого калия, раствор выливают в 4 л подлежащего очистке этанола. Выпадает темный осадок, который постепенно оседает на дно. Через сутки его отделяют фильтрованием, этанол перегоняют, отбрасывают первую и последнюю порции.
3.Очистка хлороформа и дихлорметана.
Для определения гормонов лучше всего использовать хлороформ марки «для наркоза», содержащий небольшое количество спирта, что делает его белее стабильным. Для очистки хлороформа других марок, а также для регенерации тех порций растворителя, которые уже один раз использовались для экстракции гормонов, их взбалтывают с концентрированной серной кислотой на протяжении 1 – 2 рабочих дней, при этом серная кислота темнеет тем скорее, чем белее загрязнен растворитель. Встряхивание проводится в темноте, удобно пользоваться магнитной мешалкой, закрывая колбу светонепроницаемым колпаком. После этого кислоту отсасывают, хлороформ промывают водой, а затем на протяжении нескольких часов концентрированным раствором аммиака, 1 н гидроксидом натрия или насыщенным раствором натрия карбоната, затем опять промывают водой и осушают безводным натрия сульфатом или натрия карбонатом. После осушения растворитель перегоняют, используя стеклянный перегонный аппарат на шлифах, нагреватель – электрический с водяной баней. Конкретный режим очистки зависит от качества исходного растворителя. Об эффективности очистки лучше всего судить, поставив холостой или калибровочный опыт.
4. Очистка эфира
Для удаления перекисей эфир взбалтывают с 10 % раствором сульфида железа (2) в 1 н серной кислоте, затем промывают водой. Проверка наличия перекисей: 200 мл эфира выпаривают, остаток растворяют в 2 мл абсолютного этанола. Из этого количества отбирают 0,2 мл, к которым добавляют 0,2 мл 2 % спиртового раствора метадинитробензола и 0,2 мл 5 н раствора едкого калия в метаноле. Окраска не должна превышать той, которая развивается при добавлении к тем же реактивам 5 мкг кристаллического кетостероида.
5. Определение содержания 17 – КС в моче по реакции с метадинитробензолом (реакция Циммермана в модификации Креховой).