Термохемилюминесцентный иммуноанализ (стр. 2 из 2)
Расстояние между донором и акцептором, при котором эффективность ПЭ равна 0,5, обозначается символом RQ. Рассчитанная нами по методу Страйера величина R0донорно-акцепторной пары Sj-адамантанон - ДФА оказалась равной 15,3 А. График зависимости между эффективностью ПЭ и R0представлен на рис. 11.
Из приведенных данных следует, что для эффективного усиления TXJI с помощью СКП-ДФА среднее расстояние между остатками 1,2-диоксетана и ДФА не должно превышать 15 А. Это условие легко выполнить, связав ковалентно оба компонента. Напротив, введенные в белок ТХЛ-метки и СКП-ДФА будут распределены неупорядоченно и важной характеристикой системы будет среднее расстояние между метками. Необходимое для эффективного переноса энергии число меток ДФА на молекулу белка можно оценить теоретически, приняв ряд допущений. Согласно результатам наших расчетов, для БСА это число равно 6. С молекулой IgGнеобходимо связать уже не менее 20 остатков СКП-ДФА. Эти расчеты; показывают, что неупорядоченное введение в молекулу IgG ТХЛ-меток и ДФА, скорее всего, не приведет ни к оптимальному усилению TXJI, ни к активным конъюгатам антител. Напротив, неупорядоченное введение этих двух меток в меньшие по размеру мак-; ромолекулы должно привести к конъюгатам с высокой удельной! активностью. Экспериментально достигнутое максимальное усиление ТХЛ с помощью ПЭ равно 40. Так, если БСА обработать сна-ч чала N-пвдроксисукцинимидным эфиром и затем большим! избытком СКП-ДФА по стандартной методике, то образуется водорастворимый двойной конъюгат, проявляющий ярко-голубую флуоресценцию и ярко-голубую хемилюминесценцию.
Удельная активность ТХЛ этого своеобразного источника света не изменяется при разбавлении. Двойной конъюгат характеризуется практически постоянным отношением сигнал/концентрация в диапазоне от 0,1 мг/мл до 0,1 нг/мл. Предел обнаружения белка на применявшемся приборе с коэффициентом эффективности счета 0,14% равен 10"18 моль. Препарат можно хранить без разложения или потери активности и использовать в качестве метки путем ковалентного связывания с другими белками или небольшими молекулами в зависимости от цели анализа. В нашей лаборатории разработан термохемилюминесцентный иммуноанализ с флуоресцентным усилением с использованием в качестве метки описанного выше двойного конъюгата БСА.
Количественное определение интенсивности термохемилюминесценции
Для быстрого измерения интенсивности ТХЛ необходимо нагреть пробу до 200-250°С. Соответственно проба должна представлять собой сухой остаток на подложке. Подходящая подложка должна быть термически устойчивой, не излучать в соответствующей области спектра в интервале температур 100-250°С, не тушить сигнал ТХЛ и выполнять функции носителя в обычных методиках иммуноанализа. Этим требованиям удовлетворяют такие материалы, как каптон-500Н и тефлон. Компоненты реакционной смеси можно адсорбировать на дисках диаметром 0,9 см, изготовленных из этих полимеров. В твердофазном иммуноферментном анализе типа ELISA эти диски не уступают обычным полистирольным микропланшетам или даже превосходят их. После очень простой очистки фоновый сигнал полимера каптон-500Н составляет около 1 имп./с при 240°С.
Так, при проведении анализа типа FATIMA диски из капто-на-500Н, на которые нанесен двухсайтовый иммунный комплекс с ТХЛ-меткой, помещают на небольшой нагревательный элемент. Интенсивность ТХЛ измеряют путем подсчета фотонов за время нагревания от 100°С до 250°С и термостати рования при этой температуре.
Прибор для подсчета фотонов состоит из биметаллического фотоумножителя типа EMI 9893 QA/350 в неохлаждаемом блоке ТЕ 1004/TS/110 и светопроводяще-го стеклянного стержня, который соединен с интерференционным фильтром, пропускающим короткие волны. Сигнал на ФЭУ предварительно усиливается и подается на блок дискриминатор - счетчик фотонов. Держатель с нагревательным элементом и образцом соединяют с блоком ФЭУ таким образом, чтобы оставался небольшой свободный объем камеры, который продувается слабым током газообразного азота. Принципиальная схема и внешний вид прибора представлены на рис. 14-16.
В полностью автоматизированной системе робот Movemasterперемещает диски с пробами к нагревателю и затем закрывает камеру. Далее включаются питание блока ФЭУ и нагреватель пробы. По завершении определенного периода нагревания питание блока ФЭУ отключается, робот открывает камеру, извлекает и отбрасывает пробу. Результаты измерения ТХЛ регистрируются и обрабатываются компьютером Apple, который контролирует всю систему, а также строит калибровочный график. Обсуждаемая система способна обрабатывать 4 специальных микротитровальных планшета стандартного размера, содержащих в общей сложности 240 проб. Система отличается исключительно высокой гибкостью, что позволяет применять ее в исследовательских работах при разработке любых анализов на основе ТХЛ-меток.
Определение хорионического гонадотропина человека с помощью термохемилюминесцентного иммуноанализа
Разработана методика двухсайтового твердофазного термохемилюминесцентного иммуноанализа для определения хорионического гонадотропина человека с использованием дисков из каптона-500Н, на которые нанесены моноклинальные антитела против hCG и моноклональные антитела против другого эпитопа,.содержащие несколько остатков ТХЛ-метки. В этом анализе принцип усиления не применялся.
Приготовление меченых антител. К моноклональным мышиным антителам против hCG, растворенным в 1мл 0,9% NaCl, добавляют 1мл 100 мМ боратного буфера и затем 200 мкл раствора соединения VIII в 1,4-диоксане. Раствор осторожно перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Реакцию останавливают диализом против боратного буфера при 4°С. Как показало измерение активности ТХЛ-метки этого конъюгата, эффективность введениях метки равна 40%.
Иммунная реактивность конъюгата моноклональных антител против hCG с 10 остатками соединения VIII подтверждена методом иммуноферментного анализа типа ELISA путем изучения конкурентного связывания в сравнении с коныогатом моноклональных антител против hCG с пероксидазой хрена. Удельная активность ТХЛ-метки полностью сохранялась при добавлении бычьей сыворотки и стандартов hCG.
Выполнение анализа. На диски из каптона-500Н наносят специфические мышиные моноклональные антитела против /3-цепи hCG, дважды промывают боратным буфером и инкубируют в течение ночи с 160 мкл стандарта hCG, содержащего 40% бычьей сыворотки, 50-60% боратного буфера и 19 мкг/мл меченого конъюгата. На рис. 17 представлена калибровочная кривая, построенная по усредненным результатам 5 измерений. Интенсивность ТХЛ определяли с помощью автоматической системы, описанной в предыдущем разделе.
Заключение
Обладающие хемилюминесцентной активностью соединения можно получить в форме, позволяющей связать их с компонентами иммунохимической реакции. При использовании в качестве ТХЛ-меток. устойчивых 1,2-диоксетанов для количественного определения меченых соединении достаточно одного нагревания. По указанным ниже причинам для этой цели особенно удобны 1,2-диоксетаны, получаемые из различных функционально-замещенных адамантилиденадамантанов.
1)Термическая, а также химическая устойчивость этих меток позволяет долго хранить как сами метки, так и их коньюгаты, применять буферные растворы с широким диапазоном рН, компоненты сыворотки и органические растворители, не опасаясь заметного разложения этих меток.
2)Термохемилюмннесцентные реакции - это процессы первого порядка. Поэтому кинетика реакции не зависит от содержания метки в пробе. Ошибочные измерения можно отбросить с помощью алгоритма подгонки кривой.
3)Для измерения интенсивности ТХЛ не нужны дополнительные химические реагенты.
4)ТХЛ-меткн легко синтезировать с высоким выходом, воспроизводимой высокой степенью чистоты и высокой удельной активностью.
5)Так как эти метки бесцветны, самогашение не наблюдается и в белки можно вводить большое число меток без потери удельной активности.
6)Хотя удельная активность диадамантил-1,2-диоксетанов невысока, интенсивность ХЛ можно увеличить в 40 раз за счет переноса энергии к термически устойчивым флуорофорам, например СКП-9,10-дифенилантрацену. При добавлении акцепторных соединений типа флуоресцеина или рубрена наблюдается сдвиг ТХЛ в красную область спектра.
7) В небольшие белки можно вводить большое число ТХЛ-меток и остатков ДФА; таким образом, получают эффективно термохемилюминесци-рующий белок, который в свою очередь можно использовать как водорастворимую метку. В настоящее время удается определять ТХЛ только сухих проб, выдерживающих нагревание до 250°С; водные растворы анализировать нельзя. Большинство элементов этого нового метода постоянно совершенствуются, но наиболее существенного улучшения следует ожидать от разработки системы нагревания проб, в которой повышение температуры должно быть очень быстрым, строго локализованным и осуществляться точно по заданной программе. Методика определения hCG убедительно показывает, что цели, стоящие перед иммуноанализами типа ТИА и FATIMA, вполне достижимы.