Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на нейтрофилы и факторы мукозального иммунитета (стр. 5 из 11)

Доза лазерногоизлученияДж\см²	Скорость НАДФН-оксидазной реакции пмоль/мин х10⁶клеток
Доза лазерногоизлученияДж\см²	Неактивированныенейтрофилы	Нейтрофилы, активированные ЛО с постоянной генерациейимпульса	Нейтрофилы, активированные ЛО с переменной генерациейимпульса
0,018	1.03±0.16	1.93±0.18,**	2.13±0.12,*
0,036	1.80±0.11	2.81±0.11,**	3.08±0.21,*
0,072	2.72±0.25	3.75±0.25,**	4.07±0.15,*
0,14	3.01±0.31	3.79±0.31,**	4.17±0.30,*
0,28	4.11±0.15	5.31±0.15,**	5.99±0.10,*
0,56	4.51±0.13	5.29±0.23,**	6.21±0.19,*
1,1	4.61±0.33	5.91±0.13,**	6.95±0.10,*

Примечание:*-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучёнными с постоянной генерацией импульса, ***- достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучёнными с переменной генерацией импульса С учетом поправки Бонферрони критический уровень р составил 0,003. U-критерий Мана- Уитни.

Для изучения секреторной функции нейтрофилов был проанализирован цитокиновый состав (таблица 4), содержание высокомолекулярных пептидов-дефенсинов и бактерицидного протеина BPI (таблица 5), биохимический состав супернатантов нейтрофилов (таблица 6). В результате проведённых исследований нами было выявлено, что нейтрофилы, полученные из периферической крови доноров и инкубированные в термостате в течение 30 мин. при температуре 37ºС в растворе Хенкса выделяют глюкозу, метаболиты азота, ионы кальция, магния, ИЛ-1α, ИЛ-1β, РАИЛ1, ИЛ-8, ФНО-α. Появление этих продуктов в супернатантах неактивированных нейтрофилов обусловлено, возможно, секреторной дегрануляцией клеток, происходящей при инкубации нейтрофилов не в физиологических условиях invitro. Поэтому термин «неактивированные нейтрофилы» мы можем принимать лишь условно, как выделенные без индуктора секреции клеток, т.е. без лазерного излучения. Уровни изучаемых цитокинов в супернатантах неактивированных нейтрофилов доноров достоверно отличались от содержания в секреторных продуктах, выделенных после активации нейтрофилов лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса. Эти изменения имели однонаправленный характер, степень выраженности которых была различной.

Таблица 4

Содержание цитокинов в супернатантах нейтрофилов неактивированных и активированных лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса (М±m)

Цитокины	Супернатанты неактивированныхнейтрофилов	Параметры излучения
Цитокины	Супернатанты неактивированныхнейтрофилов	СупернатантынейтрофиловактивированныеЛО с постояннойгенерациейимпульса	СупернатантынейтрофиловактивированныхЛО с переменнойгенерациейимпульса
ИЛ-1α, пг/мл	51.42±0.29	59.83±0.54, **	62.43±4.41,*
ИЛ-1β, пг/мл	14.28±0.12	20.36±0.87* ,***	24.47±12.21, *
РАИЛ-1,пг/мл	99.36±2.42	99.67±1.92	100.98±2.10*
ИЛ-8, пг/мл	44.48±1.39	69.8±1.88, **	136.8±21.71, *
ФНО -α, пг/мл	2.21±0.45	4.24±0.75, **	6.31±0.33, *

Примечание:*-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с постоянной генерацией импульса, ***- достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с переменной генерацией импульса С учетом поправки Бонферрони критический уровень р составил 0,003. U-критерий Мана- Уитни.

Анализ цитокинового состава показал достоверно более высокое содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-1α, ИЛ-1β, РАИЛ1, ИЛ-8, ФНО-α в супернатантах нейтрофилов крови доноров, облучённых лазером с переменной генерацией импульса (таблица 4). Возможно, данный вид излучений является стимулирующим фактором, приводящим к достоверно, по сравнению с неактивированными и активированными НИЛИ с постоянной генерацией импульса НГ доноров более выраженной секреции преформированных цитокинов. Помимо этого, в секреторных продуктах нейтрофилов были обнаружены высокомолекулярные пептиды, обладающие иммунотропной активностью-дефенсины и бактерицидный/индуцированный протеин BPI (таблица 5).

Таблица 5

Содержание дефенсинов и белка BPI в супернатантах нейтрофилов неактивированных и активированных лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса (М±m)

Пептидные продукты нейтрофилов	Супернатанты неактивированныхнейтрофилов	Параметры излучения
Пептидные продукты нейтрофилов	Супернатанты неактивированныхнейтрофилов	СупернатантынейтрофиловактивированныеЛО с постояннойгенерациейимпульса	СупернатантынейтрофиловактивированныхЛО с переменнойгенерациейимпульса
Дефенсины, пг/мл	4.47±0.95	4.78±0.59, **	6.47±0.45,*
BPI, пг/мл	0.67±0.20	0.75±0.22, **	0.99±0.33,*

Результаты исследования биохимического состава секреторных продуктов неактивированных и стимулированных лазерным излучением нейтрофилов показали следующее (таблица 6). Продукты метаболизма оксида азота (NO) присутствовали как в супернатантах нейтрофилов интактных, так активированных ЛО НГ. Содержание метаболитов азота в супернатантах облучённых лазером нейтрофилов увеличилось в 3,7 раза по сравнению с содержанием продуктов метаболизма оксида азота с супернатантах интактных НГ. Более чем на 50% увеличилось содержание нитратов и нитритов в секреторных продуктах нейтрофилов, облучённых лазером низкой интенсивности.

Таблица 6

Биохимический состав в супернатантах нейтрофилов неактивированных и активированных лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса

Компоненты	Супернатанты неактивированныхнейтрофилов	Параметры излучения
Компоненты	Супернатанты неактивированныхнейтрофилов	СупернатантынейтрофиловактивированныеЛО с постояннойгенерацией импульса	СупернатантынейтрофиловактивированныхЛО с переменнойгенерацией импульса
Нитраты, мкмоль/л	15.21±3.43	31.11±7,23, **	39.19±7,26,*
Нитриты, мкмоль/л	43.1±5.17	82.38±22,83, **	99.38±22.11,*
Общее содержание метаболитов оксида азота, мкмоль/л	28.31±8.35	137.91±35,24, **	166.9±34.29,*
Са²⁺ моль/л	0.22±0.01	0.52±0.02, **	0.70±0.04,*
Мg,²⁺ моль/л	0.98±0.02	0.58±0,04, **	0.48±0.03,*
Общее содержание глюкозы мкмоль/л	4.95±0,05	3.25±0.05, **	2.01±0.02,*

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с постоянной генерацией импульса, ***- достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с переменной генерацией импульса С учетом поправки Бонферрони критический уровень р составил 0,003. U-критерий Мана- Уитни.

Возможно, повышение содержания NO при воздействии НИЛИ происходит за счёт усиления окислительно-восстановительных процессов, в том числе ускорения реакции окисления аргинина ферментом NO-синтазой, результатом которой и является образование оксида азота (Артюхов В.Г., 2005). Выделяющийся в межклеточное пространство NO является реакционно-способным соединением с широким спектром биологического, в том числе, бактерицидного действия (Захарова М.А., 2003).

При изучении содержания глюкозы в супернатантах неактивированных и активированных нейтрофилов доноров было отмечено, что в ответ на стимуляцию гранулоцитов лазером низкой интенсивности уровень глюкозы достоверно снижается (р<0,003, р=0,00023) с 4,95 до 2,01 мкмоль/л, возможно, такой расход глюкозы, являющейся ключевым метаболитом биохимических процессов возможен вследствие повышения энергетических затрат клетки при её стимуляции лазерным излучением (Бережная Н.М., 1998; Маянский А.Н. и соавт., 1989).

Активация нейтрофилов лазером низкой интенсивности с постоянной генерацией импульса выявила рост уровня секреции ионов Са²⁺, в супернатантах нейтрофилов более чем в 3 раза по сравнению с неактивированными нейтрофилами доноров. Возможной причиной увеличения концентрации ионов Са^2+, после стимуляции НГ лазерным излучением является быстрый выход из органел- кальциосом в цитозоль большого количества ионов Са²⁺, в результате чего мы наблюдаем рост в супернатантах ионов кальция (GlossmanH., 1999). Зарегистрированное снижение концентрации ионов Мg²⁺возможно, происходят в результате его расходования на процессы активации процессов метаболизма, а именно катаболизма в клетке (Эллиот В., 2000). Сравнительный анализ биохимического, цитокинового состава супернатантов нейтрофилов облучённых лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса показал, что, несмотря на различный количественный состав секреторных продуктов, полученных в результате активации клетки лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса, данные изменения имели однонаправленный характер.

Наиболее значимые изменения показателей зарегистрированы при воздействии лазером с переменной генерацией импульса. Полученные нами данные о составе супернатантов нестимулированных и стимулированных нейтрофилов, в целом, совпадают с результатами исследования А.В. Чукичева (1996), И.Е.Третьяковой (2003). Зарегистрированное нами усиление функциональных возможностей нейтрофилов и продуктов их секреции с учётом биоэффективных доз воздействия лазерным излучением низкой интенсивности послужило основанием для проведения объективного исследования иммунотропных эффектов воздействий лазерного излучения низкой интенсивности в практике.