Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи було представлено:
на 5-тій Парнасівській конференції „Molecularmechanismsofcellularsignaling”, 26-29 квітня 2005 р., м. Київ; на IX-му Українському біохімічному з’їзді, 24-27 жовтня 2006 р, м. Харків; на вчених радах Інституту біохімії ім.О.В.Палладіна НАН України.
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 3 статті в Українському біохімічному журналі, 2 тез доповідей на наукових конференціях та заявлено 1 патент на винахід.
Структура та обсяг роботи. Дисертацію викладено на 126 сторінках друкованого тексту. Робота складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини, що включає опис методів дослідження і викладення результатів експериментів та їх обговорення, висновків, списку використаної літератури, що містить 201 посилання на роботи вітчизняних та зарубіжних авторів. Результати досліджень представлені в 10 таблицях і 25 рисунках.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури наведена інформація про наукові дослідження ендоканабіноїдної системи: описані фізико-хімічні властивості п’яти груп ендоканабіноїдів та відомі рецепторні та позарецепторні механізми реалізації їх біологічних ефектів. Показаний зв’язок ендоканабіноїдів з імунною системою, сигнальною системою NO та наведено дані про роль NAE в канцерогенезі. Описано особливості злоякісних клітин, їх характерні відмінності від нормальних клітин та взаємовідносини пухлини і організму.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження invivo. Карцинома легень Льюїс (3LL) метастазує гематогенно в легені практично в 100 % випадків. Пухлину перещеплювали внутрішньом’язево в праву задню лапку миші (1,2 млн. клітин карциноми в 0,1 мл середовища 199). Досліди виконували на мишах-самцях лінії С57Bl/6 вагою 20-23г. Тварини утримувались на звичайному раціоні харчування. NSE (однорідна стабільна водна суспензія, що отримана за допомогою ультразвукового диспергування) вводили peros по 1мг на тварину (50 мг/кг маси тіла) та по 5 мг на тварину (250 мг/кг маси тіла) двічі на день, що в перерахунку на добу складає 100 мг/кг маси тіла та 500 мг/кг маси тіла відповідно. Початок введення препарату мишам в групі „Пухлина + NSEз 4 дня” — з 4 дня після перещеплення пухлини, а в групі „Пухлина + NSEз 21 дня” — з 21 дня після перещеплення до закінчення експерименту. Контрольним групам тварин –„Інтактні тварини”, „Пухлина” (миші, яким було перещеплено карциному Льюїс), вводили рівну кількість дистильованої води. Тварин декапітували на 33 добу після перещеплення. Кількість мишей в групах на кінець експерименту — 4-6.
Цисплатин (0,1 % водний розчин) готували безпосередньо перед використанням і вводили групі мишей «Цисплатин» внутрішньоочеревинно по 0,2 мл на мишку 1 раз в три дні, починаючи з 10 дня після перещеплення карциноми Льюїс. За умов досліду тваринам-пухлиноносіям вводили perosNSE по 1мг та по 5 мг на тварину двічі на день з 4 дня після перещеплення пухлини, а з 10 дня починали вводити Цисплатин. Такі тварини були поділені в групи „Цисплатин + NSE 1 мг” і „Цисплатин + NSE 5 мг”. Порівняльний аналіз проводили з групою мишей-пухлиноносіїв „Контроль”.
За динамікою росту пухлин слідкували за допомогою заміру діаметрів стегна тварини в двох взаємно перпендикулярних площинах з періодичністю 1 раз в 7 днів. Гальмування росту пухлини розраховували в порівнянні з розмірами контрольної групи тварин.Для оцінки інтенсивності процесу метастазування використовували такі критерії: середня кількість метастазів на тварину в групі, середній об’єм метастатичного ураження легенів на тварину в групі.
Процеси перекисного окислення ліпідів оцінювали за накопиченням продуктів перекисного окислення, реагуючих з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реагуючих продуктів) [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972].Рівень антиоксидантної активності злоякісних та умовно нормальних клітин визначали за активністю каталази [Королюк М.А. и др.,1988].
Активність аргінази визначали колориметричним методом за реакцією з використанням диметилгліоксиму, в результаті якої утворюється сечовина. Активність аргіназної реакції виражали в нмоль сечовини за 1 хв на мг білка.
Поліаміни визначали за кількістю путресцина за допомогою 2,4 – динітрофторбензола. (ДНФБ )(Serva, ФРГ) [Сяткин С.П., 1980 ].
Ліпідний екстакт готували, використовуючи метод [BlighE.G., DyerW.I., 1959]. Отриманий ліпідний екстракт висушували на роторному випаровувачі для видалення розчинника. Сухий ліпідний залишок зберігали в бензолі при температурі – 18 оС.Розділення індивідуальних фосфоліпідів проводили за методом двовимірної тонкошарової хроматографії (ТШХ) на підготовленому силікагелі [Беленький Б.Г. и др., 1984], нанесенному на скляних платівках 6 х 6 (см).Ідентифікацію індивідуальних фосфоліпідів проводили з урахуванням відомих значень Rfрозподілу ліпідних плям стандартних розчинів фосфоліпідів та за допомогою якісних реакцій на функціональні групи. Для визначення ліпідних плям платівку обприскували 10% розчином сірчаної кислоти в метанолі. Вміст загальних та індивідуальних фосфоліпідів у ліпідних екстрактах визначали за допомогою молібдатного реагента [VaskovskyV.E. и др., 1975].
Рівень вільного та естерифікованого холестеролу визначали на газорідинному хроматографі на скляних колонках (0,5 м ) з носієм 1,5 % OV-1 на ChimaliteW (80-100 меш) при t+250 оC і розраховували відносно стандартного розчину β-ситостеролу.
Метилові ефіри жирних кислот отримували, використовуючи методичні прийоми, наведені W.WChristie [ChristieW.W., 1979], після чого проводили кількісний аналіз жирних кислот за допомогою газо-рідинної хроматографії на хроматографі CarloErba (Італія) з полум’яно-йонізаційним детектором на скляній колонці, яка була заповнена 10 % фазою SP-2300 (Silar 5 CP) на “ChromosorbW/HP” при програмованій температурі 140-175-225-250 о С (2 оС /хв).
Сфінгозин визначали за методом, основаним на його властивості утворювати забарвлений комплекс з метилоранжем, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації сфінгозину [LauterCJ, TramsCG., 1962].
Дослідження invitro. Щобз’ясувати можливість впливу NSE на пухлинні клітини іншого типу як онкологічну модель використовували клітини лінії L1210 лейкемічних лімфоцитів миші (♀ № 234, сублінія 212, лінія DBA). Клітини культивували у скляних 20 см2 культуральних флаконах Карреля у середовищі DMEM (Sigma, США) з додаванням 10 % сироватки крові плодів великої рогатої худоби (Sigma, США). Для проведення дослідів клітини висівали на пластикові 24-лункові планшети в кількості 5х105 клітин на лунку. В інкубаційне середовище додавали водно-спиртовий розчин NSE (10-4, 10-6, 10-8 М). Час дослідної експозиції – 24 - 96 годин. Оцінку життєздатності клітин проводили за тестом забарвлення трипановим синім. Для виявлення клітин з конденсованим або фрагментованим ядром використовували такі флуоресцентні барвники: DAPI, Хехст 33342 та акридиновий оранжевий.
Для дослідження впливу NSE на інтенсивність апоптозу використовували післяопераційну адренокортикальну тканину надниркових залоз людини (альдостерому та умовно нормальну тканину, що межує з пухлиною), яку одержували з хірургічного відділення Інституту ендокринології та обміну речовин ім.В.П. Комісаренка АМН України. Тканина паралельно досліджувалась патологоанатомами. Післяопераційну тканину надниркових залоз людини переносили на лід, відділяли пухлинну тканину від умовно нормальної, додавали водно-спиртовий розчин NSE (10-4, 10-6, 10-8 М) та інкубували зрізи протягом трьох годин при 37 оС в 1 мл інкубаційного середовища. Після 3 годин інкубації проби швидко охолоджували, гомогенізували і виділяли ДНК. Для визначення інтенсивності фрагментації ДНК використовували електрофорез в агарозному гелі. Гелі після електрофорезу фотографували цифровою відеокамерою в трансілюмінаторі. Фрагменти ДНК сканували за допомогою програми „PhotoCaptMw. Кількісну оцінку інтенсивності апоптозу проведено по полосам, що відповідають 400 та 200 пар нуклеотидів. Інтенсивність фрагментації ДНК визначали по долі площі її фрагментів на сканограмі по відношенню до загальної кількості ДНК на доріжці. Дані порівнювали з контрольними зразками пухлинної тканини, до яких додавали водно-спиртовий розчин без NSE.
Статистичний аналіз проводили з використаннямt-крітерію Стьюдента; вірогідними вважали дані при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Вплив N-стеароїлетаноламінуна ріст і метастазування карциноми Льюїс у мишей. В результаті досліджень було показано, що NSEгальмує ріст пухлини і на початковій стадії розвитку пухлини, і на етапі вже сформованої неоплазми (введення NSE з 4 дня після перещеплення і з 21 дня після перещеплення, рис.1), при цьому NSE знижує кількість метастазів та зменшує об’єм метастатичного ураження легенів на різних етапах розвитку пухлини (табл.1).Також спостерігається гальмування росту пухлини за умов введення різних доз NSE (рис.2).
Ефект N-стеароїлетаноламіну на ріст клітинної лінії L1210.
Антипухлинний ефект N-стеароїлетаноламіну вивчали також на лейкемічних клітинах лінії L1210 мишей. На рис. 9 показано, що за умов введення NSE спостерігається гальмування проліферації клітин, причому максимальний ефект виявляється через 48 год після введення препарату до клітинного середовища.
Таким чином, отримані результати свідчать, що N-стеароїлетаноламін може гальмувати ріст пухлини та процес метастазування незалежно від стадії розвитку неоплазми. Антипухлинний ефект NSEспостерігається також на інших типах трансформованих клітин, що в подальшому може бути корисним при застосуванні NSE в антипухлинній терапії.