Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані поглиблюють знання про перебіг посттравматичного регенераційного процесу у спинному мозку. Позитивний ефект імплантації гідрогелю та ТКНЦ, отриманий на моделі травматичного пошкодження спинного мозку, виявляє доцільність використання цих методів при розробці нових клінічних варіантів відновного лікування наслідків спінальної травми.
Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є власним науковим дослідженням автора. Сумісно з науковим керівником, проф., д.мед.н. В.І. Цимбалюком визначені мета та завдання роботи, обговорено результати дослідження та сформулювано висновки. Автором самостійно проведено аналіз вітчизняної та закордонної літератури, а також аналіз патентної ситуації стосовно теми дослідження, вдосконалено модель травматичного пошкодження спинного мозку, розроблено протокол проведення імплантації гідрогелю та ТКНЦ, виконано експериментальні дослідження, проведено облік, обробку та інтерпретацію даних моніторингу функції задніх кінцівок, проаналізовано результати дослідження. Сумісно із д.мед.н. В.М. Семеновою проведено дослідження культуральних властивостей клітин НЦ, а також культивування клітин НЦ у присутності промітотичних факторів росту і передтрансплантаційну підготовку суспензійних культур. Сумісно з проф., д.мед.н. Л.Л. Чеботарьовою та Л.М. Сулій проведено електрофізіологічне дослідження стану нервово-м’язового апарату. Сумісно з д.мед.н. В.М. Семеновою проведено світлооптичне патоморфологічне дослідження тканини спинного мозку тварин різних експериментальних груп та здійснено аналіз отриманих даних. Сумісно з проф., д.мед.н. А.Т. Носовим та В.В. Васлович проведено електронно-мікроскопічне дослідження тканини спинного мозку тварин різних експериментальних груп і здійснено аналіз отриманих даних. Сумісно з А.П. Черкасом проведено статистичну обробку первинних цифрових даних.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені на ІІІ-му з’їзді трансплантологів України (Донецьк, 2004), Всеросійській науково-практичній конференції „Поленовские чтения” (Санкт-Петербург, Росія, 2007), 61-ій Міжнародній науково-практичній конференції студентів та молодих вчених „Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 2007).
Апробація дисертаційної роботи відбулася на засіданні кафедри нейрохірургії Національного медичного університету імені О.О.Богомольця МОЗ України (протокол №8 від 5 грудня 2007 р.), а також на спільному засіданні Вченої ради Державної установи «Інститут нейрохірургії імені академіка А.П. Ромоданова АМН України» та кафедр нейрохірургії Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л Шупика МОЗ України та Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України (протокол №1 від 4 січня 2008 р.).
Публікації. Результати дисертаційного дослідження висвітлені у 6 друкованих наукових працях: 3 статтях у фахових виданнях, включених до переліку ВАК України, та 3 тезах доповідей, представлених на національних та міжнародних з’їздах і науково-практичних конференціях.
Структура та об’єм дисертації. Дисертація складається зі вступу, 4 розділів, підсумку, висновків, додатків та списку використаних джерел. Робота викладена на 290 сторінках друкованого тексту, проілюстрована 159 рисунками. Список використаних джерел включає 254 найменувань, з них 21 — кирилицею та 233 — латиницею. Робота доповнена 4 додатками, у яких наведені результати статистичної обробки первинних цифрових даних, викладені у 65 таблицях.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ
Матеріали та методи. Отримання, культивування та морфологічне дослідження клітин НЦ щура здійснювали згідно з загальноприйнятими протоколами культивування нервової тканини (В.П. Божкова та співавт., 1988). Для збагачення культур проліферативно активними клітинами нейрогенного типу отриману суспензію культивували в живильному середовищі DMEM (Dulbecco’smodіfіed Eagle’smedіum, Sigma) стандартного складу, що включало фетальну телячу сироватку (40%), глюкозу (800 мг/%), інсулін (0,2 ОД/мл), з наявністю рекомбінантного епідермального фактору росту людини (hEGF, експресований E. colі; Sіgma) у концентрації 40 нг/мл і рекомбінантного фактору росту фібробластів людини (hFGF, експресований E. colі; Sіgma) у концентрації 20 нг/мл.
Макропористий гідрогель (полі[N-(2-гідроксипропіл)-метакриламід]) був синтезований в лабораторії E. Pinet (FISOTechnologiesInc., Quebec, Canada) шляхом гетерогенної полімеризації із наступним очищенням у спиртових і водяних ваннах, після чого гідрогель стерелізували у дистильованій воді шляхом автоклавування і запаювали в скляні ємності. Росфасований в стерильних умовах після транспортування гідрогель утримували протягом усього експерименту при температурі 6–8° С. Вміст однієї пробірки використовували для імплантації 4–6 тваринам протягом одного операційного дня.
Вивчення ефективності імплантації гідрогелю та алотрансплантації клітин НЦ на моделі ЛПП спинного мозку проводили на білих безпородних щурах-самцях, вагою 250–300 г та середнім віком 5–6 міс. У ході дослідження були сформовані наступні експериментальні групи: група „контроль” – моделювання ЛПП спинного мозку (n=24); група „гідрогель”, тваринам якої безпосередньо після нанесення травми в ділянку ушкодження спинного мозку імплантували гідрогель (n=37); група, тваринам якої через 4 тиж після нанесення травми й імплантації гідрогелю в тканину спинного мозку та навколишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=12); група, тваринам якої через 8 тиж після нанесення травми й імплантації гідрогелю в тканину спинного мозку та навколишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=8); група, тваринам якої через 7 тиж після нанесення травми в тканину спинного мозку та навколишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=4); група, тваринам якої через 13 тиж після нанесення травми в тканину спинного мозку та навколишній субарахноідальний простір вводили суспензію клітин НЦ (n=4). Група тварин, котрим через 4 тиж після моделювання травми та імплантації гідрогелю трансплантували клітини НЦ була розділена на дві підгрупи: тварини із кращими (n=5) та гіршими (n=7) показниками відновлення функції задньої іпсилатеральної місцю травми кінцівки (ЗІК) на момент виконання ТКНЦ. Для порівняльної оцінки даних електрофізіологічного дослідження провідності спинного мозку було сформовано групу інтактних тварин (n=11).
У якості моделі травматичного пошкодження спинного мозку була використана модель його лівобічного половинного перетину (ЛПП) в нижньогрудному відділі. Оперативні втручання здійснювали під загальним знеболенням, що досягалося шляхом внутрішньоочеревинно введення суміші розчинів ксилазину (Sedazіn, Bіowet, Польща) з розрахунку 15 мг/кг маси і кетаміну (Calypsol, Gedeon Rіchter) з розрахунку 70 мг/кг маси. Ламінектомію проводили на рівні ТXI, зберігаючи при цьому суглобові відростки. Після наскрізного проколу офтальмологічним списоподібним скальпелем тканини спинного мозку вздовж лівого краю задньої серединної артерії (лезо скальпеля знаходилося у сагітальній площині, а рукоятка – перпендикулярно дорзальній поверхні спинного мозку) у рану спинного мозку заводили одну з бранш офтальмологічних ножиць таким чином, щоб при повному їх відкритті в проміжку між браншами потрапляла тканина усієї лівої половини поперечника спинного мозку (ножиці встановлювали рукоятковою частиною в площині поперечного перерізу спинного мозку, перпендикулярно дорзальній його поверхні). В декілька прийомів проводили перетин тканини лівої половини поперечника спинного мозку. Контроль повноти перетину проводили за допомогою скривленого по ребру офтальмологічного пінцета.
В область дефекту тканини спинного мозку імплантували фрагмент гідрогелю. Протибактеріальну терапію здійснювали за допомогою одноразового введення необхідної дози біциліну-3 або біциліну-5. У якості протизапальної і протинабрякової терапії використовували введення розчину дексаметазону.
Техніка формування доступу на рівні ТXII–LI під час повторного втручання з приводу ТКНЦ аналогічна описаній вище. Клітинну суспензію вводили в тканину спинного мозку на вказаному рівні нижче місця травми за допомогою інсулінового шприца як гомолатерально, так і контрлатерально по відношенню до вогнища травми в загальному об’ємі 0,075 мл (~2,25´106 живих клітин). Окрім цього, клітинну суспензію вводили в субарахноідальний простір у ділянці сформованого операційного доступу в об’ємі 0,06 мл (~2´106 живих клітин).
Оцінку функціональної активності задніх кінцівок прооперованих тварин проводили згідно із 21-бальною шкалою, запропонованою D.M. Basso, M.S. Beattie та J.C. Bresnahan (ВВВ, 1995). З метою встановлення більш тонких особливостей динаміки відновного процесу проводили дослідження величини швидкості зміни показника функції (ПФ): швидкість зміни ПФ (бали/тижні) = ПФ станом на кінець попереднього тижня – ПФ станом на кінець наступного тижня.
З метою коректного висвітлення ефективності ТКНЦ вибірки зрівняння формували з урахуванням спектру індивідуальних значень ПФ ЗІК на момент проведення ТКНЦ.
Електрофізіологічне дослідження здійснювали під загальним знеболенням (див. вище). Широко відкривали канал хребта на рівні ТIII–TV, мобілізували спинний мозок вздовж двох сегментів і під його вентральну поверхню перпендикулярно ростро-каудальній осі підводили 2 паралельні гачкоподібні кінці стимулюючого сталевого електроду.
Реєструючі активний та пасивний голкові сталеві електроди встановлювали у товщу рухової точки бічного широкого м’язу стегна обох кінцівок. Стимуляцію та обробку первинних результатів проводили за допомогою електронейроміографа з системою комп’ютерного аналізу потенціалів B.A.S.I.S. Е.Р.М. (OTEBiomedica, Італія). Для подальшого аналізу відбиралися найвищі отримані впродовж дослідження однієї тварини показники. При цьому визначали такі показники електричної активності нервово-м’язового апарату, як максимальна амплітуда (МА) М-відповіді м’язу, латентний період реєстрації та швидкість проведення збудження (ШПЗ).