Незважаючи на точність одержуваного результату, метод безпосереднього секвенирування не використовується в практичній охороні здоров'я через технічні складності проведення дослідження і високої вартості робіт. Разом з тим наявність інформації про первинну структуру РНК ВГС є референтним методом генотипування, а наявність приладів для автоматичного секвенирування спрощує одержання результату. В даний час у більшості випадків для генотипування РНК ВГС застосовуються методи, засновані на використанні ПЛР із типоспецифічними праймерами. Гібридизація ампліфікованих продуктів із адсорбованими геноспецифічними зондами (з 5'-нетрансльованої зони РНК ВГС), адсорбованими на нітроцелюлозній мембрані.
Методичний арсенал визначення генотипів ВГС не обмежується перерахованими вище способами і містить у собі різноманітні методи:
генотипування на основі аналізу профілів рестрикції ампліфікованих продуктів. Продукти ампліфікації фрагментів РНК ВГС (NS5 область РНК ВГС) розщеплюються рестриктазами. Фрагменти, що утворилися, розрізняються по довжині в залежності від наявних усередині них сайтів рестрикції, по яких йде розщеплення. Результати електрофорезу і їхнє порівняння дозволяють ідентифікувати генотип ВГС у досліджуваному зразку. Порівняння результатів генотипування з даними секвенирування продемонструвало високий рівень збігу результатів - 95% [Ильина, 2000].
Генотипування на основі методу оцінки конформаційного поліморфізму одноланцюгових фрагментів ДНК. Як об'єкт дослідження обраний 5'-нетрансльований регіон РНК ВГС, що має мінімальний набір нуклеотидних варіацій, що відрізняють генотипи друг від друга. Цей факт визначає можливість застосувати загальні праймери при генотипуванні.
СЕРОТИПУВАННЯ Анти-ВГС стало можливим завдяки дослідженням P. Sіmmonds зі співавторами, який встановив наявність антитіл, спрямованих до генотипспецифічних епітопів, інформація про які кодована NS4 зоною РНК ВГС.
Серотипування анти- ВГС у порівнянні з генотипуванням РНК ВГС має такі переваги, як простота проведення реакції і більш низька вартість. Разом з тим, цей метод ні в якому разі не може замінити генотипування. Результати серотипування анти-ВГС свідчать про типову приналежність анти-ВГС при поточній чи раніше перенесеній інфекції. У деяких випадках (найбільше часто в хворих гемофілією) реєструється одночасне виявлення анти-ВГС різних підтипів, що може свідчити про множинне інфікування різними субтипами і генотипами ВГС. Крім того, у пацієнтів з гепатитом С на фоні вираженого імунодефіцитного стану РНК можуть бути єдиним маркером, що унеможливлює проведення серотипування [Мукомолов, 1999].
1.6 Лікування
До недавніх часів кращим засобом проти ВГС вважався інтерферон, ці ліки, що інгибують реплікацію вірусу. Медикаментозний інтерферон, що використовується для лікування гепатитів включає: ІNFγ-2b (інтрон-а), ІNFγ-2a (роферон-а) і ІNF alfacon-1 (інферген). Але інтерферони працюють тільки в 20% випадків [Саринсон, 1998]. Зараз ін'єкції інтерферону комбінують з пероральним введенням рибавірина (Виразол) - антивірусний агент широкого спектра дії. Лікування звичайно триває від 6 міс. до року, і є успішним приблизно лише для 40% хворих [Goodson, 1992].
Недавні дослідження показали, що інші ліки, пролонгований інтерферон, є в 2 рази більш ефективним, ніж звичайний інтерферон. У січні 2001 року Харчове і Лікарське Керування запропонували використання пролонгованого інтерферону - γ-2В - для лікування гепатиту С [Hoofnagle, 2001].
Відомо, що функції інтерферону (ІFN) в організмі різноманітні, однак найбільш важливої з них є антивірусна, яка здійснюється шляхом стимуляції вироблення антивірусних білків у інтактних клітинах, що забезпечує в них розвиток т. н. антивірусного стану [Григорян, 1990]. Унікальні властивості ІFN з'явилися причиною активної розробки різних технологій його виробництва і клінічного застосування. Незважаючи на успіхи ІFN-терапии і розширення спектра його застосування, існує багато проблем, зв'язаних з цим видом лікування. Частота порушень ІFN статусу, розширення представлень про спектр захворювань, при яких необхідна терапія препаратами ІFN, висока вартість, можливість виникнення ряду ускладнень від їхнього застосування, стимулювали дослідження з вивчення індукторів ІFN.
Побічний ефект від застосування лікарської терапії інтерфероном містить у собі симптоми, схожі з грипом і тимчасове зниження вмісту гемоглобіну в крові (анемія), лейкоцитів і тромбоцитів у крові. Хронічні побічні ефекти - які складають приблизно половину при прийнятому лікуванні інтерфероном-рибавірином - включають сильну втому, занепокоєння, дратівливість і депресію. Невеликий відсоток людей випробує психологічні чи суїцидальні настрої. Вчені розробляють використання інгібіторів протеаз для лікування людей із ВГС. Ці ж медикаменти використовуються для деяких людей, хворих СНІДом. У майбутньому можливе лікування ВГС за допомогою генної терапії. Найкраще лікування для людей на кінцевій стадії печінкової хвороби (печінкова недостатність) є пересадження печінки [Подимова, 1998].
Встановлено, що в ряді випадків застосування індукторів ІFN має переваги перед використанням екзогенних ІFN. Так, індуктори ІFN стимулюють вироблення власних ІFN, що не володіють антигенностью. При цьому їхній синтез знаходиться під контролем ІЛ і білків-репресорів і не досягає рівня, здатного зробити дію, що ушкоджує, організм. Індуктори ІFN розрізняються по хімічній природі, по тому на які клітки-продуценти вони діють, синтез якого виду ІFN вони викликають, а також за часом досягнення максимальної концентрації ІFN у сироватці і тривалості дії препарату [Григорян, 1990].
Аміксин відноситься до класу флуоренів і є низькомолекулярним індуктором ендогенного інтерферону.
Амікcин поліпшує перебіг запального процесу, активує макрофаги, збільшує кількість протизапальних цитокінів, підвищує секрецію лізосомних ферментів, інгибує ферменти, субстратом яких служить ДНК: ДНК-полімераза, топоізомераза, зворотня транскриптаза. Про здатність аміксина брати участь у моделюванні імунної системи можна судити за результатами, що свідчать про активацію NK [Григорян, 1990].
У зв'язку з недостатністю інтерфероногенеза, що спостерігається в хворих вірусними гепатитами [Дидковский, 2000], у комплексному лікуванні гострих і хронічних вірусних гепатитів перспективним є застосування індукторів синтезу інтерферону [Івахів, 2001, Малий 2001]. Одним з індукторів синтезу інтерферону є циклоферон - низькомолекулярний індуктор інтерферону, що відноситься до класу акридонів.
Циклоферон є низькомолекулярним індуктором інтерферону, що визначає широкий спектр його біологічної активності (противірусної, імуномодулюючої, протизапальної, антипроліферативної, протипухлинної та ін.). Препарат індукує синтез раннього a-типу-інтерферону. У тканинах і органах, що містять лімфоїдні елементи, циклоферон індукує високий рівень інтерферону, що зберігається протягом 72 годин. Основними клітинами-продуцентами інтерферону після введення циклоферону є макрофаги, Т- і В-лімфоцити. У залежності від вихідного стану має місце активація тієї чи іншої ланки імунітету. Препарат індукує високі титри альфа-інтерферону в органах і тканинах, що містять лімфоїдні елементи (селезінка, печінка, легені), активує стовбурні клітини кісткового мозку, стимулюючи утворення гранулоцитів. Циклоферон активує Т-лімфоцити і природні кілерні клітини, нормалізує баланс між субпопуляціями Т-хелперів і Т-супресорів [Руденко, 2000, Романцев, 2000].
Циклоферон ефективний у відношенні вірусів кліщового енцефаліту, грипу, гепатиту, герпесу, цитомегаловірусу, вірусу імунодефіциту людини, вірусу папіломи й інших вірусів [Шостакович-Корецкая, 2000].
Імуномодулюючий ефект циклоферона виражається в корекції імунного статусу організму при імунодефіцитних станах різного походження й аутоімунних захворюваннях.
Застосування циклоферона при лікуванні гострого і хронічного вірусного гепатиту С сприяло більш швидкому поліпшенню самопочуття хворих, відновленню апетиту, зникненню жовтяниці. Клінічному поліпшенню відповідала позитивна динаміка біохімічних і імунологічних змін [Ершов , 1999, Солдогуб, 1999].
Аналізуючи данні наведені в огляді літератури слід зазначити, що на даний час використання імуномоделюючих препаратів, таких як аміксин і циклоферон є найбільш вдалим для лікування ВГС. Тому вивчення їх дії при лікуванні гепатиту С є доцільним.
2. Матеріали і методи
Нами проводилося дослідження лікувальної ефективності застосування імуномоделюючих препаратів у хворих на хронічний гепатит С. Дані отримували при вивченні клітинного, гуморального імунітету та біохімічних тестів у хворих, які знаходилися на стаціонарному лікуванні у НІІ очних хвороб і тканинної терапії ім.. В.П. Філатова.
Матеріалом для дослідження була кров хворих на гепатит С.
2.1 Визначення показників клітинного імунітету
Визначення вмісту лімфоцитів і лейкоцитів у крові
Зважили пробу, отриману в результаті з'єднання 0,008 мл крові і 0,1 мл 10 % розчину оцтової кислоти в процесі забору крові, ретельно перемішали наконечником піпетки і заповнили нею камеру Горяєва. Підрахували кількість лімфоцитів і лейкоцитів (клітки крові чітко розрізнялися за формою ядра (у 20 великих квадрантах із застосуванням об'єктива х40).
Абсолютний вміст кліток а 1 мкл крові визначали по формулах:
Лей =К*а /1000
де Лей — вміст лейкоцитів у крові, тис/мкл
а — кількість лейкоцитів, у 20 великих квадрантах камери
Горяева.
Лі = К*б /1000
де Лі — вміст лімфоцитів у крові, тис/мкл
б — кількість лімфоцитів, у 20 великих квадрантах камери Горяєва.
К — коефіциєнт перерахунку: тут К= 169.
Визначення комплексу показників розеткоутворення і фагоцитозу
Приготування суспензії лейкоцитів
Лейкоцити, що містяться в суспензії, отриманої в результаті лізису еритроцитів у процесі забору крові, осадили центрифугуванням планшета при 200 д протягом 5 хв., надосадкову рідину злили із планшета. До отриманого осаду лейкоцитів долили 0,2 мл середовища 199, і одержали суспензію лейкоцитів, яку використали для постановки комплексу тестів розеткоутворення і фагоцитозу.