4. Концентрация
Большинство современных спектрофотометрических методов измерения глюкозы используют ферментативную реакцию с участием восстановленной формы никотинамид-аденин-динуклеотида (НАДВ) в качестве ко-фермента и поглощение на длине волны 340 нм. Поглощение света и молярный коэффициент поглощения НАДВ позволяют напрямую рассчитывать концентрацию глюние козы после завершения реакции, проводимую в оптимизированных условиях. Более часто концентрацию определяют путем кинетического измерения, сравнивая образец со стандартом. Высокий молярный коэффициент поглощения (НАДВ) помогает снизить величину матричного эффекта. Кинетическое измерение помогает устранить вычитание фона за счет незначительного снижения точности. После 50-ти кратного разведения концентрация растворенных веществ по массе составляет 4.0 г/литр в случае цельной крови и меньше - в плазме. Скорость ферментативной реакции зависит от активности вещества (или молярности). При более низкой концентрации воды в разведенном образце по сравнению с концентрацией воды в калибраторе, ферментативная реакция в образце протекает с несколько большей скоростью, но производимое воздействие будет незначительным из-за высокой степени разведения. Для методов, которые включают осаждение белков, может также иметь место положительная стандартная ошибка, зависящая от разведения и концентрации белка. Осаждение приводит к неоднородности системы. В осажденном белке концентрация глюкозы ниже, и, следовательно, в водной фазе она выше, чем в гомогенном растворе, содержащем белок. Несмотря на эти (минимальные) теорети ческие расхождения, стандартный химический клинический анализатор измеряет концентрацию глюкозы (количество глюкозы на объем образца) с достаточной аккуратностью и точностью.
Результаты измерения, полученные с помощью биосенсоров, требующих разведения, ниже истинной молярности и весьма близки к концентрации. Эти приборы регистрируют концентрацию, основанную на концентрации глюкозы в калибраторе.
Разведение снижает концентрацию всех компонентов, за исключением растворителя, концентрация которого приближается к максимальной концентрации чистого растворителя. После разведения, например, в отношении 1:25, концентрация воды в образце и водном калибраторе отличается менее чем на 1% на момент измерения. Вследствие этого появляется небольшое положительное отклонение менее 1% в регистрируемой концентрации, зависящее от степени разведения и от исходной концентрации растворенных веществ.
5. Плазма в сравнении с цельной кровью
Если за основу взять концентрацию (количество глюкозы на литр образца), то концентрация глюкозы в плазме выше, чем глюкозы в эритроцитах, поскольку в плазме концентрация воды выше, чем в эритроцитах. В отличие от биосенсоров прямого считывания глюкозы, сенсоры, измеряющие глюкозу в разведенных образцах, дают результаты, зависящие от концентрации воды в образцах. Поэтому, биосенсоры, требующие разведения образца, будут давать различные результаты для цельной крови (или гемолизованной крови) и соответствующей плазмы.
Для примера рассмотрим образец крови с гематокритом (Hct) равным 0.43. Концентрация воды в эритроцитах равна 0.71 кг/литр. Концентрация воды в плазме равна 0.93 кг/литр. Концентрация воды (кг Н2О/литр) в образце крови должна быть промежуточной между этими двумя величинами и равна (0.43)(0.71) + (1 - 0.43)(0.93) = 0.84. Соотношение концентрации воды и, следовательно, концентрации глюкозы в плазме и в цельной крови составляет 0.93/0.84, или 1.11. Это соотношение зависит от гематокрита. Снижение гематокрита приводит к увеличению концентрации глюкозы в цельной крови и наоборот. Если известно, что величина гематокрита находится за пределами нормы, то концентрация глюкозы в цельной крови может "корректироваться в соответствии с гематокритом" до значения, наблюдаемого при стандартном гематокрите 0.43 с помощью формулы 0.84/(0.93 - 0.22 х Hct). К сожалению, на некоторые методы могут оказывать влияние эритроциты или гемоглобин. Значения концентраций глюкозы в плазме и цельной крови не взаимозаменяемы из-за существующей разницы в концентрациях глюкозы в плазме и в цельной крови (в отличие от современной практики, принятой во многих учреждениях). Врачебное решение принимается на основании различных референтных диапазонов и диагностических критериев. Рекомендация, предлагаемая здесь, заключается в том, чтобы независимо от материала исследования, регистрировать только концентрацию глюкозы в плазме. Глюкоза и вода свободно распределяются между эритроцитами и плазмой, так что величина молярности (а не концентрация) глюкозы идентична в эритроцитах и плазме. При заданной концентрации глюкозы в плазме, концентрация глюкозы в цельной крови зависит от гематокрита, поскольку в эритроцитах концентрация воды меньше чем в плазме. Концентрация же глюкозы в плазме не зависит от гематокрита. Активность глюкозы в плазме, в которой концентрация воды варьирует относительно слабо, практически пропорциональна концентрации глюкозы, в отличие от цельной крови, в которой гематокрит может меняться и нарушать взаимосвязь. Поэтому концентрация глюкозы в плазме (а не концентрация в цельной крови) наиболее точно отражает активность глюкозы. Для большинства целей концентрация в плазме физиологически более подходит для измерения и регистрации чем концентрация в цельной крови.
Не всегда обращают должное внимание на тип образца крови. Например, АДА рекомендует максимально допустимый CV (система плюс пользователь) в 10% при концентрациях глюкозы 1.7 - 22 ммоль/л и максимальное отклонение в 15% от референтного метода. Другими словами, АДА рекомендует, чтобы при определении глюкозы ошибка анализа не превышала 5%. Систематическая 11% разница только между цельной кровью и плазмой уже превышает рекомендуемую допустимую ошибку. Согласно современным рекомендациям ВОЗ и АДА, нижний предел содержания глюкозы в крови натощак для диагностики сахарного диабета составляет 6.1 ммоль/литр. Верхний предел для сравнения глюкозы в плазме крови натощак составляет 6.0 ммоль/литр. Ошибка в технике получения образца или неправильное определение типа образца или референтного диапазона могут привести к неверной интерпретации результата и ошибке в диагнозе. Согласно данным, опубликованным в Американском Журнале Клинической Патологии, регистрация значений глюкозы в цельной крови является анахронизмом и сравнима с регистрацией концентрации калия в
цельной крови вместо плазмы. Производители и химики-клиницисты должны всегда регистрировать концентрацию глюкозы только в плазме для устранения этого риска, независимо от типа образца и метода измерения (рис.1).
6. Преобразование концентрации глюкозы в цельной крови в эквивалентную концентрацию в плазме
Для преобразования концентрации глюкозы в цельной крови в эквивалентную концентрацию в плазме документ IFCC рекомендует использовать величину 1.11 - постоянный коэффициент, установленный для концентраций воды в данных двух типах образцов. Эта отношение было подтверждено экспериментально. На некоторые методы измерения могут оказывать дополнительное влияние матричные эффекты. Индивидуальный пересчет, основанный на гематокрите, может внести дополнительную ошибку, кроме того, он меньше подходит и требует дополнительной информации. Пересчитанная (цельная кровь плазма) таким образом, концентрация глюкозы будет также зависеть от гематокрита, как и описываемая ранее концентрация глюкозы в цельной крови.
7. Оценка гликемии при диагностике сахарного диабета: актуальные проблемы и пути их решения
Уровень глюкозы крови имеет основное доказательное значение в диагностике сахарного диабета – синдрома хронической гипергликемии. Корректная клиническая интерпретация результатов определения гликемии и, следовательно, адекватная диагностика сахарного диабета во многом зависят от качества работы лабораторной службы. Хорошие аналитические характеристики современных лабораторных методов определения глюкозы, осуществление внутрилабораторной и внешней оценки качества проведения исследований обеспечивают высокую надежность лабораторного процесса. Но это не решает вопросов сопоставимости результатов измерения глюкозы, полученных при анализе различных видов образцов крови (цельная кровь, ее плазма или сыворотка), также как и проблем, обусловленных снижением уровня глюкозы в процессе хранения этих проб.
На практике содержание глюкозы определяют в цельной капиллярной или венозной крови, а также в соответствующих образцах плазмы. Однако нормативные пределы колебаний концентрации глюкозы значимо отличаются в зависимости от вида исследуемого образца крови, что может быть источником интерпретационных ошибок, приводящих к гипер- или гиподиагностике сахарного диабета.
В цельной крови концентрация глюкозы ниже по сравнению с плазмой. Причина этого несоответствия – меньшее содержание воды в цельной крови (на единицу объема). Неводная фаза цельной крови (16%) представлена, главным образом, белками, а также липидно-белковыми комплексами плазмы (4%) и форменными элементами (12%). В плазме крови количество неводной среды составляет лишь 7%. Таким образом, концентрация воды в цельной крови, в среднем, равна 84%; в плазме – 93%. Очевидно, что глюкоза в крови находится исключительно в виде водного раствора, так как распределяется только в водной среде. Поэтому значения концентрации глюкозы при расчете на объем цельной крови и на объем плазмы (у одного и того же пациента) будут отличаться в 1,11 раза (93/84 = 1,11). Эти различия были учтены Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) в представленных нормативах гликемии [1]. Определенное время они не были причиной недоразумений и диагностических ошибок, поскольку на территории отдельной страны для определения глюкозы селективно использовали либо цельную капиллярную кровь (постсоветское пространство и многие развивающиеся страны), либо плазму венозной крови (большинство европейских государств).