Цель работы. Получение каллусной ткани из сердцевины стебля взрослого растения табака в условиях in vitro.
Теоретическое обоснование. Сущность метода выращивания изолированных тканей растений и получения каллуса заключается в том, что выделенный кусочек ткани (эксплант) стерилизуют и переносят на искусственную питательную среду, содержащие минеральные соли, органические вещества, фитогормоны. На такой питательной среде клетки начинают делиться. Различно дифференцированные клетки претерпевают in vitro дедифференциацию и переходят к делению, образуя первичный каллус. Возникший на эксплантах каллус через четыре-шесть недель переносят на свежую питательную среду (субкультивируют). Техника культивирования тканей позволяет получить длительную, пересадочную каллусную культуру из любых живых тканевых клеток интактного растения. Каллус-это неорганизованная масса ткани, состоящая из дедифференцированных клеток. Образование и рост каллуса контролируются фитогормонами группы ауксинов и цитокининов.
Каллусы на искусственных питательных средах, включающих фитогормоны, легко образуются на эксплантах из самых различных органов: из асептически прорастающих семян, отрезков стеблей и корней, изолированных фрагментов паренхимы, тканей клубня, изолированной сердцевины стебля, из листа, зародышей и др.
В качестве примера рассмотрим метод получения каллусной ткани из сердцевины стебля взрослого растения табака.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Взрослые растения табака. Химический стакан с дистиллированной водой, конические колбы на 100 мл со стерильной питательной средой Мурасиге и Скуга. Вата, 96%-ный спирт, 0,1%-ный раствор сулемы или диацид, стаканы со стерильной водой, стерильные марлевые мешочки, стерильный пробкобур, стерильный скальпель, стерильная чашка Петри.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Из стеблей табака в фазе бутонизации или цветения вырезают участки с хорошо развитой, но еще не одревесневевшей сердцевиной (второе-третье междоузлие). Выбранные участки стебля разрезают на части длиной 5 см и моют в мыльном растворе щеткой, затем отмывают от мыла водопроводной водой и ополаскивают дистиллированной водой. Чистые участки стебля помещают в стакан с дистиллированной водой и переносят в ламинар.
Для стерилизации протирают стебли табака 96%-ным спиртом, и погружают в марлевых мешочках в 0,1%-ный водный раствор сулемы на 10-15 мин или в раствор диацида (1:1000) на 25 мин. После стерилизации стебли промывают в пяти порциях дистиллированной воды, оставляя в каждой на 5 мин. Затем из центральной части стебля вырезают стерильным сверлом для пробок (диаметр 5 мм) столбик сердцевиной ткани и помещают в стерильную чашку Петри. Стерильным скальпелем удаляют участки ткани вблизи прежних срезов (концевые участки). Вырезанная сердцевина не должна содержать элементов флоэмы и камбия. Полученные цилиндрики сердцевины разрезают скальпелем в чашке Петри на кусочки длиной 2-3 мм и помещают на поверхность агаровой среды. Посуду с эксплантами табака помещают в термостат (в темноту) при температуре +25оС для культивирования. Через три недели анализируют результаты по образованию каллуса. Таким же образом получают каллус из корнеплодов картофеля и моркови.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1. В чём заключается сущность метода выращивания изолированных тканей растений и получения каллуса?
2.Что представляет собой каллус?
3.Из каких органов на искусственных питательных средах могут образоваться каллусы?
Лабораторная работа №9
СОМАТИЧЕСКИЙ ЭМБРИОГЕНЕЗ В КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ
Цель работы. Регенерация растения люцерны in vitro на примере соматического эмбриогенеза на стерильной питательной среде Гамборга (В-5).
Теоретическое обоснование. Регенерацию in vitro рассмотрим на примере соматического эмбриогенеза у люцерны. Переход дедифференцированных каллусных клеток к вторичной дифференцировке и образование организованных структур в каллусной ткани зависят от соотношения гормонов в питательной среде. Преобладание цитокининов над ауксинами приводит к индукции стеблевого органогенеза или к соматическому эмбриогенезу. Преобладание ауксинов над цитокининами способствует образованию корней в каллусной ткани-корневому органогенезу.
В каллусной ткани люцерны при пересадке ее на среду, содержащую 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП), индуцируется образование почек и эмбриоидов. Через две-три недели от начала действия индуктора морфогенеза на каллусах развиваются зеленые почки и эмбриоиды длиной 0,5-2,0 мм. Их образованию предшествует возникновение на светлой поверхности каллусов зеленых точек, которые появляются через несколько дней после пересадки. Эмбриоиды в основном образуются у тетраплоидных сортов и у гибридов люцерны, почки чаще формируются у диплоидных форм. Иногда почки и эмбриоиды могут развиваться одновременно на одном каллусе.
Для получения растений-регенерантов возникшие почки и эмбриоиды помещают на среду без гормонов, где через две-три недели формируются растения. Иногда наблюдается нарушение нормального развития растений (образование каллуса, преимущественное развитие корня и побега, утолщение различных органов). В этом случае материал следует пересадить на среду без гормонов, с уменьшенной вдвое концентрацией всех компонентов. Срок, необходимый для прохождения всех стадий регенерации растений из тканевых культур (от листового экспланта до регенеранта), составляет около двух месяцев.
Оборудование и техническое оснащение лабораторной работы. Культура каллусной ткани, полученной из листа люцерны. Колбы на 50 мл со стерильной питательной средой В-5 (табл.2.4). Стерильная чашка Петри, стерильные скальпели.
Содержание и порядок выполнения лабораторной работы. Соблюдая стерильность, каллус переносят в чашку Петри, разделяют на кусочки размерами 5х5 мм и помещают на новую питательную среду В-5 с добавкой 6-БАП (0,2 мг/л). Эта среда стимулирует развитие в каллусной ткани клеток меристематического и эмбрионального типа, из которых в дальнейшем формируются почки и эмбриоиды. Пересаженные каллусы ставят для инкубации в световые камеры (16 ч освещения). Через три недели наблюдают развитие зеленых почек и эмбриоидов. Полученные эмбриоиды и почки используют для получения растений-регенерантов. Их переносят с соблюдением строгой стерильности на питательную агаризованную среду В-5 без гормонов и инкубируют в световой камере. В одну колбу на 50 мл с 25 мл среды следует высаживать четыре-шесть почек эмбриоидов. Через три недели отмечают образование побегов из почек и формирование растений-регенерантов. На одном экспланте может появиться до нескольких десятков побегов. Когда побеги достигают высоты 10 мм, их следует разделить и перенести на среду для укоренения: В-5 с добавлением нафтилуксусной кислоты (НУК) концентрацией 0,1 мг/л. Через 5-10 дней отмечают появление корней.
Требования к отчету по лабораторной работы
Лабораторные записи необходимо вести аккуратно, поэтапно, в соответствии с порядком выполнения лабораторной работы.
Заносить тему, цель, материалы и оборудование, необходимые в лабораторной работе, основные этапы проведения опытов и результаты в виде тезисов, либо в табличном или графическом виде, а также с необходимыми рисунками.
Контрольные вопросы.
1. От чего зависят переход дедифференцированных каллусных клеток к вторичной дифференцировке и образование организованных структур в каллусной ткани?
2.Что происходит с каллусной тканью люцерны при пересадке ее на среду, содержащую 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП)?
3.Что нужно предпринять, если наблюдается нарушение нормального развития растений?
Лабораторная работа №10
СУСПЕНЗИОННАЯ КУЛЬТУРА.
ПОЛУЧЕНИЕ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ИЗ КАЛЛУСА
Цель работы. Получение суспензионной культуры из каллуса в жидкой питательной среде в стерильных условиях.
Теоретическое обоснование. Клеточная суспензия – источник ценных биологически активных веществ, служит исходным материалом для клеточной селекции. Суспензионная культура может быть использована как модельная система для изучения путей вторичного метаболизма, синтеза ферментов, экспрессии генов.
Получение экономически важных веществ растительного происхождения в пробирочной культуре связано со способностью культивируемых клеток многих растений синтезировать различного рода продукты, которые обычно получают из целых растений. При этом появляется возможность создавать принципиально новые продукты, превосходящие традиционные. Клеточные культуры – продуценты имеют определенные преимущества перед традиционным растительным сырьем, так как продукт можно получать независимо от ареала распространения растения, сезона, погоды, почвенных условий.
Культура клеток позволяет оптимизировать и стандартизировать условия выращивания и, следовательно, автоматизировать технологический процесс. Если к тому же учесть быстрое истощение естественных сырьевых ресурсов, то преимущества использования клеточных технологий становятся очевидными.
В культуре клеток могут синтезироваться специфические для высших растений экономически важные соединения: алкалоиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, терпеноиды и терпены, эфирные масла, стероиды, пряности, инсектициды, натуральные красители и многие другие ценные вещества (6). Так у нас в стране налажено промышленное производство биомассы ценного лекарственного растения женьшеня. Из 0,1 г экспланта женьшеня за 1,5 месяца культивирования in vitro получают до 5 г ткани. Средний прирост корня женьшеня в оптимальных условиях на плантациях за год достигает лишь 8 г. Следовательно, культивирование in vitro, несомненно, является рентабельным производством. По качеству экстракты, полученные из каллусной ткани, почти не отличаются от экстрактов из натурального корня женьшеня.