«Информационные технологии для обработки люминесцентных изображений биологических объектов» (стр. 2 из 4)

Альтернативой к коммерческому программному обеспечению выступает открытое бесплатное программное обеспечение, в основном предназначенное для академического использования. Для бесплатного ПО характерны: универсальность, общедоступность, возможность модификации кода под специализированную задачу. Большинство бесплатных пакетов не обладает интерфейсом и рассчитано на пользователей имеющих навыки программирования. Наиболее распространенные пакеты бесплатного программного обеспечения представлены в таблице 1 [16].

Таблица 1 – Пакеты бесплатного программного обеспечения

Пакет	Описание	Интернет ресурс
ImageJ	Обработка изображений	http://rsbweb.nih.gov/ij
OME	Базы данных изображений	www.openmicroscopy.org
Bio-Formats	Библиотека обмена метаданными	www.loci.wisc.edu/omel
CellProfiler	Автоматическое вычисление характеристик клеток	www.cellprofiler.org
VisBio	Многофакторный анализ изображений	www.loci.wisc.edu/visbio
Bisque	База данных для семантического анализа	www.bioimage.ucsb.edu

Раздел 2 Разработка алгоритмов анализа изображений и моделирования

2.1 Сегментация изображения

2.1.1 Общие этапы алгоритмов сегментации объектов на изображении

Построение трёх масок изображения имеет общие этапы (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Этапы построения масок

При построении монохромного изображения используются цветовые компоненты, соответствующие цвету испускаемому красителем, маркирующего исследуемый объект. Пороговое значение находиться по необработанному монохромному изображению. Построение бинарного изображения осуществляется на необработанном или на сглаженном гауссовским фильтром монохромном изображении и если необходимо, оно наращивается, используя метод распространения. Размер фильтра определялся как минимальный диаметр исследуемого объекта, умноженный на 3.5/3. На заключительном этапе происходит морфологическая обработка изображения.

Входные параметры необходимые для сегментации изображения: image – файл обрабатываемого изображения; TumorMinDiameter – минимальный размер области опухоли; TumorMaxDiameter – максимальный размер области опухоли; NucleuMinDiameter – минимальный размер ядра; NucleuMaxDiameter – максимальный размер ядра; CellMinDiameter – минимальный размер клетки; CellMaxDiameter – максимальный размер клетки.

2.1.2 Построение маски опухоли

Так как информация о цитоплазме содержится в зелёной компоненте, то для построения монохромного изображения использовалась только зелёная компонента. Пороговое значение находилось по методу Оцу. Построение маски опухоли строилась на неслаженном изображении. Затем на полученном бинарном изображении заполнялись пустоты меньшие размеров ядер, так как эти пустоты соответствуют областям, не содержащим красителя цитоплазмы, из-за наличия ядра клетки в них.

2.1.3 Построение маски ядер

Информация об интенсивности красителей ядер содержится в красной и синей компонентах, поэтому для построения полутонового изображения использовалась сумма двух этих компонент. Затем находилось пороговое значение по методу суммирования нормальных распределений. Оценки части изображения занятой ядрами (nuclei_part) строилась как отношение:

nuclei_part=N*π* R_{среднее}²/ image_square ,

где N – количество локальных максимумов на изображении,

Rсреднее=0.5*(NucleuMaxDiameter+NucleuMinDiameter), image_square – площадь изображения.

Затем найденный порог применялся к сглаженному изображению. На бинарном изображении слившиеся ядра разделялись водораздельным методом на основе интенсивностей. И с разделённого бинарного изображения удалялись объекты, площадь которых меньше минимальной площади ядер[17].

2.1.4 Построение маски клеток

Информация об интенсивности красителей цитоплазмы содержится в зелёной компоненте, которая использовалась как полутоновое изображение. Пороговое значение находилось по методу суммирования нормальных распределений, где часть изображения занятая цитоплазмой считалась, как 0.8 части изображения занятой ядрами. Найденный порог применялся к сглаженному изображению. Полученное изображение наращивалось по методу распространения, используя маску ядер. На бинарном изображении слившиеся клетки разделялись водораздельным методом на основе интенсивностей. И с разделённого бинарного изображения удалялись объекты, площадь которых меньше минимальной площади клеток.

2.2 Экспериментальные изображения клеток раковой опухоли

Биологический образец – опухоль рака груди. В цитоплазме раковых клеток протекают реакции с участием цитокератин 8 (CK8), который маркируется красителем Alexa Fluor 488 (l_{поглощения} = 493 нм , l_{испускания} = 518 нм). В ядрах раковых клеток находится протеин рецептор эстрогенов ER, для маркировки которого используется краситель Cy5 (l_{поглощения} = 654 нм , l_{испускания} = 673 нм), Для маркировки ядер используется краситель DAPI (l_{поглощения} = 358 нм , l_{испускания} = 461 нм) [17].

Три изображения получены при помощи конфокального микроскопа компании Delta Vision Restoration, с использованием камеры Photometrix CH350L (500 kHz, 24-bit, 2048×2048 пикселей), диапазон возможных значений интенсивности от 0 до 255. В системе установлен микроскоп Nikon TE-2000, встроенный в Delta Vision System. Оптические срезы тканей получены последовательным фотографированием с шагом 0.5 мкм вдоль оси z. с параметрами объектива – Nikon, Plan Fluor, NA 1.4 линзами. Флуоресценция регистрировалась стандартом Delta Vision для DAPI, FITC, TexasRed. Размер изображения составляет 2048 пикселей на 2048 пикселей в каждом из трех каналов, разрешающая способность: 5 пикселей на 1 мкм. На Рисунок 2 приведен пример изображения системы.

На этапе предварительной обработки проводилась нормировка гистограммы интенсивностей пикселей в зависимости от времени облучения образца.

Рисунок 2 – Пример исследуемого изображения

Раздел 3 Результаты

3.1 Сегментация экспериментальных изображений

В ходе работы выполнен анализ трех изображений, с площадью покрытия клетками окна среза 80%; и 40%, а также наличия размытых границ клеток (Рисунок 3).

Рисунок 3 – Примеры обрабатываемых изображений. А – площадь покрытия клетками окна среза 80%; Б – площадь покрытия клетками окна среза 40%; В – наличия размытых границ клеток. Далее – изображения 1, 2, 3, соответственно

Для сравнения качества сегментации использовались маски ядер и клеток. Маски, полученные при помощи разработанного алгоритма, показаны на Рисунок 4.

Рисунок 4 – Результаты обработки изображений А – маска ядер изображения 1; Б – маска клеток изображения 1; В – маска клеток изображения 2; Г – маска клеток изображения 2; Д – маска ядер изображения 3; Е – маска клеток изображения 3

Разработанные алгоритмы показали хорошее качество сегментации для изображений с большим и малым количеством клеток. Однако алгоритм сегментации требует доработки при работе с нечёткими изображениями. В этом случае маска клеток содержит искаженные границы клеток для большинства ядер.

Количество клеток на первом изображении составляет 848, на втором 229, на третьем 218. Количество пропущенных либо раздробленных ядер и клеток не превышает 5% от общего числа клеток.

В результате анализа экспериментальных изображений для каждого набора данных сохраняются три файла содержащие электронные таблицы интегральных и дифференциальных характеристик биологических объектов. На Рисунок 5 приведены примеры выходных файлов.

Рисунок 5 – Выходные файл. А – дифференциальные характеристики ядер; Б – дифференциальные характеристики изображения клеток; В – интегральные характеристики биологических объектов