Реакция агглютинации микрометодом. В последнее время в бактериологической практике нашел довольно широкое применение микрообъемный метод постановки серологических реакций с использованием специальных планшеток и микротитровальных игл .
Реакции агглютинации микрометодом ставят с холерными агглютинирующими референс-сыворотками в полистроловых микротитровальных планшетках с плоским или V-образ-ным дном, предназначенных для иммунологических реакций, используются мпкротитровальные планшетки с объемом лунок 0,4 мл и в пробирках параллельно. Предварительно планшетки тщательно промывfют проточной водой, каждую лунку прополаскивали дистиллированной водой и хорошо просушивали, затем делали надписи простым карандашом.
Во все лунки четырех рядов пипеткой-капельницей из микротитратора Такачи вносят 0,85% раствор хлористого натрия (рН 7,2) в объеме 0,05 мл, затем в первую лунку каждого ряда — того же объема соответствующей сыворотки в разведении 1:25 и проводят ее титрацию микротитроваль-ной иглой с головкой (объем 0,05 мл), удаляя из последней лунки по 0,05 мл.
После титрации сывороток во все лунки, кроме их контролей, вносят 0,05 мл взвеси исследуемой агаровой культуры. Эту манипуляцию проводят на подносе.
По окончании титрации планшет накрывают крышкой и ставят на подносе в термостат при 37° С. После 2-часовой экспозиции проводят окончательный учет реакции под стереомикроскопом (МБС-1, МБС-2) в косопроходящем свете. При учете реакции крышку с планшетки не снимают, в случае ее запотевания заменяют другой.
После учета реакции планшетку и крышку складывают в кювет и заливают 5'% хлорамином так, чтобы все лунки планшетки были заполнены дезраствором.
Исследования показали, что все холерные вибрионы классического и эльтор биоваров агглютинируются холерной видовой 0-сывороткой в микрообъемах.
Что касается агглютинабельности типоспецифическими сыворотками, то прослеживается следующая закономерность:
при постановке с сывороткой Инаба в микрометоде агглютинировались 100, а в пробирках—90% штаммов классического холерного вибриона серовара Инаба. Холерные вибрионы биовара эльтор серовара Инаба агглютинировались в планшетках и пробирках соответственно в 95 и 96% случаев. У холерных вибрионов классического и эльтор биоваров серовара Огава соотношения в обеих методиках были практически те же.
Интересен факт, что при постановке реакции агглютинации с RO-сывороткой наибольшее число штаммов, агглютинирующихся RO-сывороткой до титра, было выявлено в микрометоде; в пробирках агглютинация установлена у одного штамма.
Все штаммы вибрионов 040—056 сероваров в микрометоде не агглютинировались холерными агглютинирующими сыворотками, а в пробирках штамм II 258-1099 (040 серовара) агглютинировался всеми холерными сыворотками.
Большинство изученных штаммов представителей семейства Enterobacteraceae также не агглютинировалось холерными агглютинирующими сыворотками, за исключением Sh. flexneri 2503, у которого в пробирках была выявлена агглютинация со всеми сыворотками, и штамма S. typhimurium 21, у которого отмечена неспецифическая реакция агглютинации со всеми сыворотками как в пробирках, так и в планшетках.
При пользовании этим методом расход агглютинирующих сывороток уменьшается в 10 раз, значительно сокращается время, необходимое для постановки реакции, и ускоряется срок выдачи ответа. Кроме того, описанный метод менее трудоемок. Таким образом, стандартность, достоверность полученных результатов, высокая экономичность метода позволяют рекомендовать его при идентификации холерных вибрионов, изучении штаммов и популяции штаммов холерных вибрионов по признаку агглютинабельности.
А также:
Иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными фагами. Капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды обрабатывают холерной О-сывороткой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты «раздавленная капля», которые исследуют с помощью темнопольной и фазовоконтрастной микроскопии. В положительном случае через 3-5 минут движение вибрионов прекращается.
РИФ. Препараты из исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микроскопе. Положительным результатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым свечением в виде блестящего ободка по периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1-2 часа после начала исследования при концентрации вибрионов не менее 106 клеток в 1 мл., поэтому рекомендуется предварительно подращивание материала на питательных средах.
Экспресс-диагностика туляремии
Возбудитель туляремии (Туляре – район Калифорнии) – Franciella tularensis относится к роду с невыясненным положением в систематике микробов. Этиологическая природа туляремии была установлена в 1912 году Г.Мак-коем и Ш.Чепиным, а далее подробно изучена Э.Франсисом.
Туляремия – тяжелая кровяная зоонозная инфекция с природной очаговостью. Основные источники инфекции – водяные крысы, ондатры, зайцы, крысы, мыши. Больной человек неконтагиозен и для возбудителя является биологическим тупиком. Передается трансмиссивным путем через клещей, а нередко и контактным, алиментарным или аспирационным путем.
Возбудитель содержит нуклеопротеидный О- и оболочечный белково-липидный Vi-антиген. У перенесших болезнь вырабатывается очень напряженный и длительный иммунитет.
Материал для исследования: кровь, гной, пунктат бубона, слизь из зева.
Реакция агглютинации-рассеивания. Предложена простая, быстрая, высокочувствительная и специфичная реакция агглютинации-рассеивания, для постановки которой используется антительный диагностикум. Это суспензия темно-коричневого цвета, представляющая собой комплексное соединение шаровидных крупнодисперсных НК-частиц (Никитин и Котич) и противотуляремийных иммуноглобулинов. Препарат хранят в холодильнике при +4°С в течение 2—3 лет. По истечении 3 лет препарат можно ресенсибилизировать, так как НК-частицы высокостабильны.
Для постановки реакции агглютинации-рассеивания на тщательно обезжиренное предметное стекло наносят слева каплю исследуемого материала (опыт), справа — каплю физиологического раствора или гетерологичного микроба (контроль). Затем к каплям добавляют по одной капле НК-антительного туляремийного диагностикума. Перемешивание капель производят путем вращательного движения предметного стекла по часовой стрелке и через 1— 5 мин оценивают результаты реакции.
Учет и оценка результатов производятся невооруженным глазом, а также с помощью лупы и микроскопа в течение 1—5 мин. При положительной реакции в случае наличия туляремийного микроба или его антигена в исследуемом материале в небольших количествах (до 1—3 млн по стандарту ГКИ) отмечается феномен рассеивания шаровидных НК-частиц по всей площади капли, что регистрируется под малым увеличением микроскопа, а при концентрации 3—5 млн и более — феномен образования темно-коричневых зерен агглютината, видимых невооруженным глазом. При отрицательной реакции формируется четко очерченное, темно-коричневое пятно или точка в центре капли.
Предлагаемая реакция с использованием туляремийного НК-диагностикума предназначена для быстрого выявления специфического антигена при исследовании объектов внешней среды, пищевых продуктов, трупов павших грызунов, а также в тех случаях, когда из-за массивного пророста посторонней микрофлоры или гибели микроба выделение его посевом или через биологическую пробу не удается. Реакция строго специфична и позволяет обнаруживать туляремийный микроб в небольших количествах (300 тыс. — 1 млн. м.к./мл) или его антиген.
А также ТИФМ и др.
Экспресс-диагностика чумы
Возбудитель чумы был открыт в 1894 году в Гонконге А.Иерсеном и в его честь был назван Yersinia pestis. К роду иерсиний относятся также Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, вызывающие септические гастроэнтероколиты или иерсиниозы.
Чума – особо опасная, очень тяжелая кровяная инфекция, склонная к широкому распространению и дающая высокий процент смертности (от 20 до 100%). Это зоонозная трансмиссивная природно-очаговая инфекция. Источники - крысы, суслики, песчанки, полевки, сурки, мышевидные грызуны.
Переносчики - кровососущие насекомые.
В составе бактерий чумы содержится более полутора десятков специфических и групповых антигенов. Переболевшие приобретают пожизненный, устойчивый иммунитет фагоцитарного характера.
Материал для исследования: содержимое бубонов, отделяемое язв, мокрота, кровь, испражнения.
Метод бумажных индикаторных систем. Классические методы (посев на среды Гисса) громоздки, требуют много времени и большого количества питательных сред, имеющих ограниченный срок годности. В настоящее время эти методы не удовлетворяют запросам противочумной системы. В настоящее время наиболее перспективным методом определения ферментативной активности штаммов возбудителя чумы с целью идентификации выделяемых культур и изучения их свойств можно считать метод углеводно-бумажных дисков, предложенный В.М.Никитиным и С.В.Плугару. В качестве среды лучше использовать бульон Хоттингера, т.к. он дает наиболее быструю ферментацию – 3 часа. Целесообразно применять БИС в полевых условиях, так как наборы компактны и могут длительное время храниться при комнатной температуре.
Фаготипирование. 1. Внесение бактериофага в исследуемый материал в момент его посева на агар с генцианвиолетом позволяет обнаружить под микроскопом негативные колонии фага или «дорожку» в первые часы, когда рост бактерий еще почти не заметен (через 2,5 – 3 часа). Метод прост, доступен и дает хорошие результаты при высокой концентрации чумного микроба и при относительно большом содержании посторонних микроорганизмов.