Качественный анализ компонентов (стр. 2 из 2)
Ценной характеристикой вещества, применяемой при идентификации, является отношение сигналов, полученных для данного вещества на двух разных детекторах. Анализируемое вещество после выхода из колонки проходит сначала через первый детектор, затем через второй, а сигналы, поступающие с детекторов, регистрируются одновременно при помощи многоперьевого самописца или на двух самописцах. Обычно применяют последовательное соединение ультрафиолетового детектора (более чувствительного, но селективного) с рефрактометром, или ультрафиолетового с детектором по флуоресценции, или двух ультрафиолетовых детекторов, работающих на разных длинах волн. Относительный отклик, т. е. отношение сигнала рефрактометра к сигналу фотометра, является характеристикой вещества при условии, что оба детектора работают в своем линейном диапазоне; это проверяется введением различных количеств одного и того же вещества. Качественную информацию можно получить, работая на фотометрических детекторах, снабженных устройством для остановки потока (Stop flow) и позволяющих регистрировать спектр выходящего из колонки пика, пока он находится в проточной кювете, сравнивая его со спектром известного соединения.
Значительный интерес при идентификации представляют современные, пока еще дорогие, спектрофотометры с диодной решеткой.
Совершенно неизвестное вещество невозможно идентифицировать только с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, необходимы и другие методы.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЕЩЕСТВ НЕХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
В некоторых случаях идентификация неизвестного вещества может быть обеспечена сбором фракции, соответствующей пику хроматографического разделения, и последующим анализом этой фракции физическими или химическими методами. При этом подвижная и неподвижная хроматографические фазы должны быть очищенными, чтобы фон от фазы был сведен к минимуму, они не должны вступать в химическую реакцию с растворенным веществом, должны быть совместимыми-с хроматографической системой, используемой для разделения и обнаружения пика. Неподвижная фаза не должна выноситься из колонки. Кроме того, обе фазы не должны мешать идентификации вспомогательными методами и быть летучими, чтобы их можно было легко удалить выпариванием, фракции обычно собирают вручную, хотя возможно применение коллектора фракций. Для обеспечения чистоты, соответствующей пику собираемой фракции, внутренний объем трубки между детектором и выходом канала для сбора фракций должен быть минимальным. Этот объем должен быть измерен и внесены поправки на задержку между регистрацией пика детектором и фактическим выходом пика из канала для сбора фракций. Фракции удобно собирать в чистые, сухие, защищенные от попадания света сосуды с навинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками во избежание загрязнений. Возможен барботаж этих фракций чистым азотом или гелием. Растворители удаляют из образца выпариванием, продувкой газом, нагреванием ИК-лампой. Воду и смеси органических растворителей с водой удаляют выпариванием или лиофильной сушкой. Летучие буферные соединения удаляют при повышенных температурах.
Масс-спектрометрия — наиболее надежный и полный метод определения структуры вещества, молекулярной массы, его химической формулы. Этот высокочувствительный метод позволяет работать всего с 0,005 мкг вещества и установить как фрагментарный состав молекулы, так и ее элементное строение.
Рассмотрение идентификации неизвестных веществ с помощью масс-спектрометрии не входит в задачу данного издания. Следует отметить, однако, что большинство неионных, даже относительно малолетучих веществ удается проанализировать, используя обычно применяемый в масс-спектрометрии метод возбуждения электронным ударом. Нелетучие или ионные соединения определяют при использовании методов химической ионизации, полевой десорбции и других специальных приемов.
Образец, предварительно упаренный до 1—2 капель (объем 25—50 мкл), переносят микрошприцем во входной зонд масс-спектрометра, медленно выпаривают и анализируют. При этом необходимо выполнять холостые опыты, отбирая аналогичную фракцию до выхода интересующего нас пика, упаривая ее и вводя в масс-спектрограф, чтобы убедиться в отсутствии фоновых примесей, которые могут дать значительные пики и мешать правильной идентификации.
Для спектрального анализа в инфракрасной области требуется относительно небольшая проба — 5 мкг в твердом виде и 50 мкг в растворе. Чувствительность повышается при использовании методов, основанных на преобразовании Фурье, при этом достаточно всего 0,05 мкг пробы. Этот метод анализа прекрасно дополняет данные, полученные на масс-спектрометре, и дает информацию о функциональных группах, а иногда и о структуре вещества. Имеется несколько приемов, позволяющих анализировать разделенные на хроматографе вещества с помощью ИК-спектрофотометра. Наиболее простым является концентрированно на таблетке КВч. Собранную с хроматографа и упаренную до 1—2 капель фракцию наносят микрошприцем на 5—10 мг порошка бромида калия, причем каждую новую порцию раствора выпаривают на таблетке, пропуская сухой ток инертного газа.
Рис.1. Сосуд для концентрирования образца на микротаблетке КВг для спектрального анализа:
1 — КВг; 2 — собранная фракция; 3 — игла для подкожных инъекций; 4 — подача сухого азота
Другой путь состоит в выпаривании всей собранной фракции в сосуде с выпуклым дном (рис. 1), на котором находится порошок бромида калия. Растворитель полностью удаляют, а порошок бромида калия перемешивают и спрессовывают в микротаблетку. Таблетку из бромида калия можно непосредственно перенести в зону масс-спектрометр или в ИК-спектрофотометр. Можно вводить концентрированную фракцию в микрокювету спектрофотометра и сканировать, используя компенсирующий растворитель. Метод, основанный на преобразовании Фурье, дает довольно высокую чувствительность.
Применяют метод анализа в ИК-области с использованием комбинационного рассеяния. Растворитель, содержащий вещество, выпаривают на специальной пластинке, на которой остается тонкая пленка, после чего снимают спектральную характеристику. И здесь для повышения чувствительности желательно иметь прибор с преобразователем Фурье.
Для идентификации хроматографических пиков можно использовать спектры, определяющие структуры, содержащие 1Н, 11В, 13С, 19F, 31Р. Хотя для спектров ЯМР требуется большое количество образца (до 1000 мкг), при применении методов, основанных на преобразовании Фурье, значительно повышается чувствительность, так как многократное сканирование улучшает отношение сигнала к шуму и позволяет работать с малыми (до 5 мкг) количествами образца. Растворитель удаляют из хроматографической фракции полностью и заменяют его подходящим для ЯМР растворителем.
Из других методов идентификации следует отметить элементный анализ, требующий от 200 до 1000 мкг вещества, полярографию (0,01 мкг вещества), спектрофлуориметрию-,(0,05 мкг вещества) и, наконец, спектральный анализ в УФ- и видимой областях (0,1 мкг).
Простым, надежным и удобным способом определения функциональных групп являются цветные селективные реакции, для которых требуется всего 0,1 мкг вещества. Совпадение времени удерживания и соответствующая цветная реакция являются надежным подтверждением правильности структуры. Иногда достаточно растворитель, применяемый в жидкостной хроматографии, лишь частично упарить, а в некоторых случаях его следует полностью заменить подходящим растворителем. В табл. 2 приведены примеры цветных реакций для опознавания функциональных групп.
Таблица 2. Качественные реакции определения функциональных групп
| Тип вещества | Реактив | Приобретенный цвет Пределобнаружения, мкг | Обнаруживаемые вещества | |
| СпиртыАльдегиды Кетоны | Бихромат калия, азотная кислота Нитрат церия2,4-Динитрофенол Реактив Шиффа 2,4-Динитрофенол | ГолубойЯнтарныйЖелтый Розовый Желтый осадок | 2010020 50 20 | C1-C8 C1-C8C1-C6 C1-C6C^-C8 |
| Эфиры | Гидроксамат железа | Красный | 40 | C1-C5 |
| Меркаптаны | Нитропруссид натрияИзатинАцетат свинцаНитропруссид натрия | Красный Зеленый Желтый осадокКрасный | 5010010050 | C1-C9 C1-C9 C1-C9C2-C12 |
| Сульфиды | ||||
| Дисульфиды | Нитропруссид натрия ИзатинРеактив Гинзберга Нитропруссид натрия Гидроксамат железа — пропиленгликоль Формальдегид, серная кислота | Красный Зеленый Оранжевый Красный, голубой Красный | 501001005040 | C2-C6 C2-C6 C1-C4 C1-C4 C2-C5 |
| Амины Нитрилы | ||||
| Ароматические соединения | Бордовый | 20 | C6H^-C6H4-C4 | |
| Алифатическиенепредельныесоединения | То же | Бордовый | 40 | C2-C8 |
| Галогеналкилы | Спиртовый раствор AgNOa | Белый осадок | 20 | C1-C5 |
СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ НЕПОСРЕДСТВЕННО В ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ
Разработаны комплексные автоматизированные системы, позволяющие вводить вещество после разделения в колонке хроматографа непосредственно в спектрофотометр, но подобное оборудование является довольно дорогостоящим, требует значительной подготовки оператора и имеет ряд ограничений. Для многих задач применение таких систем нецелесообразно, а иногда даже непригодно.
Как и в случае газовой хроматографии существует несколько систем сопряжения с масс-спектрометром. Эти системы, естественно, должны обеспечивать эффективный перенос пика растворенного вещества, иметь высокую чувствительность при степени извлечения образца более 30% и давать возможность выбора нужного вида жидкостной хроматографии и режима работы масс-спектрометра. Такая система должна гарантировать быстрый, надежный анализ при минимальных требованиях к подготовке оператора. Необходимо также обеспечить возможность быстрого и полного удаления растворителя, примененного в качестве подвижной фазы; наконец, перенос пика должен быть воспроизводимым.
Возможно подключение к жидкостному хроматографу ИК-спектрометра с преобразователем Фурье. При этом химическая структура веществ, соответствующих пикам на хроматограмме, может быть идентифицирована с помощью данных, записанных в библиотеку спектральной информации системы.
Литература
1. Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях: Пер. с англ. М., Мир, 1980. 245 с.
2. Жидкостная колоночная хроматография/Под ред. 3. Дейла, К. Мащека, Я. Янака. Пер. с англ, (в 3-х томах). М., Мир, 1978.
3. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., Наука, 1985. 536 с. 9 Berendsen G. E., DeGalan R./l. Chromatogr., 1980, v. 196, No. 1, p. 21—37.
4. Cooke N.H. C., Olsen /(./J. Chromatogr. Sci., 1980, v. 18, p. 1—12.
5. Scottt C. D., Lee N. E./J. Chromatogr., 1973, v. 83, p. 383—393.
6. Kabra P. M., Marion L. J. Liquid Chromatography in Clinical Analysis. Humana Press, Cliftond, 1981. 466 p.
7. Edelson E. H., e. a./J. Chromatogr., 1979, v. 174, p. 409—419.