На том же рисунке справа показан короткий «мостик», связывающий две пересекающиеся друг с другом нити декстрана. (Заметьте, что связанные таким образом звенья глюкозы расположены симметрично.) Чем выше содержание мостиков по отношению к количеству глюкозы в нитях декстрана, тем меньше будет размер пор («ячеек»), которые они образуют.
Иногда в качестве материала гранул используют уже знакомый нам по электрофорезу полиакриламидный гель (ПААГ).
1а. «Сефакрилы».
Это — матрицы на основе того же декстрана, но в качестве связующих нити «мостиков» используется также знакомая нам по ПААГ связка — ЫТ^-метиленбисакриламид («Бис»).
2. Гели на основе агарозы — «сефаррзы».
Заметим, что максимальная концентрация агарозы, которая называлась тем, составляла 2%. А затвердевают гели агарозы при остывании из расплавленного состояния уже при концентрации в 0,4%. Однако они относительно мягкие. Для целей гель-фильтрации и других видов хроматографии используют жесткую, 4-х или 6-ти процентную агарозу, в виде сферических гранул. Поры при этом остаются еще весьма крупными. Иногда нити агарозы, все-таки сшивают дополнительно химическими «мостиками». Получаются еще более жесткие гранулы. Их торговое название «сефароза CL» (CL означает crosslinked).
2а. «Улътрагели типа АСА»»
Внутри жесткого крупнопористого каркаса агарозы полиме-ризуют ПААГ, что позволяет варьировать меньшие размеры пор в широких пределах, сохраняя жесткость гранул агарозы.
Гели на основе целлюлозы
Целлюлоза — это тоже линейный полимер, составленный из множества молекул все той же глюкозы, но связанных между собой иначе, чем в декстране. Ее часто используют в виде, так называемой, «волокнистой целлюлозы», то есть просто в виде хаотически спутанных длинных нитей полимера, без всяких дополнительных связок. В варианте «микрогранулированной целлюлозы» между нитями для увеличения жесткости вводят связующие химические «мостики». Один из типов такой целлюлозы имеет торговое название «сефацел».
В нашем ознакомительном курсе не имеет смысла приводить подробные списки матриц для гель-фильтрации из каталогов различных форм. Достаточно упомянуть, что списки эти бывают достаточно длинными, предлагая пользователю широкий выбор гранул различного размера и разной пористости, особенности которых часто бывают зашифрованы индексом, стоящим после основного названия. Так, к примеру, шведская фирма Pharmacia предлагает список из 18 типов сефадекса с индексами от G-10 до G-200, в соответствии с постепенно увеличивающимися размерами пор. Японская фирма Toyopearl выпускает 10 типов гранул для гель-фильтрации с индексами от HW40C до HW75F.
Мне остается обратить внимание читателя на то, что все матрицы для гель-фильтрации на основе декстрана, агарозы и целлюлозы в своих «сахарных» звеньях содержат множество ОН-групп, по которым возможны присоединения различных химически активных молекул, осуществляющих желательную модификацию исходно нейтральных гранул. С этими модификациями мы познакомимся в следующих главах, где речь пойдет об истинной хроматографии.
Детекторы вещества
Их назначение — вести непрерывную регистрацию состава жидкости, вытекающей из колонки, на предмет обнаружения в ней искомых фракций вещества. Поскольку одновременно с регистрацией производится автоматически отсчет пробирок в коллекторе фракций, экспериментатор освобождается от длительной проверки содержимого каждой пробирки. Распределение по ним фракций исследуемого вещества выясняется уже в ходе хроматографии.
Регистрацию белков и нуклеиновых кислот производят по поглощению света в ультрафиолетовой области спектра. Белки и пептиды поглощают в области 206-215 тц за счет пептидной связи, а также в широкой области вблизи 280 тц за счет присутствия в них ароматических аминокислот. (Неароматические аминокислоты при их хроматографическом разделении приходится специально окрашивать.) Нуклеиновые кислоты, равно как и сами нуклеиновые основания, хорошо поглощают ультрафиолетовый свет вблизи 260 тц.
В некоторых случаях (вспомним о секвенаторе ДНК) регистрировать выход вещества из хроматографической колонки можно и по флюоресценции. Однако при этом требуется дополнительная операция предварительной окраски интересующего нас вещества флюоресцентным красителем.
В подавляющем большинстве случаев регистрацию выходящих из хроматографической колонки белков, нуклеиновых кислот или их фрагментов ведут по поглощению света в ультрафиолетовой области, вблизи 280 и 260 тц соответственно.
Для этой цели служат так называемые УФ-денситометры.
Главным элементом этого прибора является источник излучения — чаще всего ртутная лампа низкого давления. Более 90% испускаемого ею света приходится на долю яркой спектральной полосы с длиной волны 254 тц. Излучение с длиной волны вблизи 280 тц можно получить с помощью той же лампы, если ее светом облучать флюоресцирующий на этой длине волны «вторичный» источник света. В новые модели УФ-денситометров устанавливают еще и безэлектродную газоразрядную лампу, дающую сильную полосу испускания с длиной волны 206 тц, что в десятки раз повышает чувствительность этих приборов по отношению к белкам.
Важным элементом УФ-детектора является кварцевая кювета, через которую непрерывно протекает выходящая из колонки жидкость. Используются кюветы как цилиндрической формы, так и прямоугольные, объемом в несколько десятков микролитров и длиной оптического пути от 2-х до 10 мм.
Многие фирмы строят свои УФ-детекторы по двухлучевой схеме: прибор оснащается дополнительной кюветой сравнения, через которую постоянно протекает чистый элюент. Луч света от лампы расщепляется с помощью полупрозрачного зеркала и проходит параллельно через рабочую кювету и кювету сравнения. Двухлучевая схема позволяет исключить при регистрации собственное поглощение света элюентом, которое может изменяться, например, в ходе градиентной элюции.
Она также компенсирует изменения яркости свечения лампы, сильно упрощая проблемы ее стабилизации.
В качестве приемников энергии в денситометрах используют высокочувствительные фотоэлементы. Напряжение с нагрузки фотоэлемента усиливается специальным, «логарифмическим» усилителем, на выходе которого появляется «сигнал» напряжения, пропорциональный оптической плотности детектируемого раствора, с амплитудой порядка 10 мВ.
Этот сигнал управляет положением пера потенциометрического регистратора («самописца»). С помощью переключателя диапазонов усиления можно установить чувствительность записи так, чтобы отклонению пэра от нулевой линии на всю ширину ленты регистратора соответствовало бы максимальное значение оптической плотности раствора.
При каждой смене нумерованных пробирок на регистратор от коллектора фракций поступает сигнал. Таким образом легко установить в каких пробирках и в каком количестве выходит из колонки интересующее нас вещество.
Коллекторы фракций
К сказанному ранее стоит добавить упоминание о многочисленности вариантов механических устройств, сменяющих пробирки под капельницей, куда поступает жидкость сразу после денситометра. В одних случаях штативы, содержащие по 10-12 пробирок перестраиваются, подобно взводу солдат, «шеренгами на прямоугольном плацу». В других конструкциях пробирки устанавливаются в несколько рядов по окружностям (или по спирали) в гнезда поворачивающегося толчками барабана, а капельница совершает необходимое перемещение от периферии к центру. Есть коллекторы, где все пробирки остаются неподвижными в своих штативах, а капельница, установлена на подвижной каретке. Перемещаясь в двух взаимно-перпендикулярных направлениях, она обходит все штативы один за другим. Смена пробирки чаще всего задается автоматически самим коллектором фракций (по выбору экспериментатора) — то ли по времени, то ли по числу капель, которое отсчитывает простое реле с фотоэлементом. Иногда сменой пробирок с помощью электрического импульса управляет перистальтический насос, привязывая тем самым смену пробирок к истинному потоку жидкости через колонку, независимо от возможных изменений скорости подачи элюента (в силу изменения сопротивления колонки) или от размера капель, который зависит от вязкости и температуры жидкости.
Для работы с радиоактивными веществами коллекторы оснащают дополнительным устройством, которое запирает выход жидкости из колонки во время смены пробирок.
Аппаратура для жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД)
Из дальнейшего будет ясно, что хроматографические процессы протекают тем быстрее (какой бы природы они не были), чем меньше размер гранул. Быстрее устанавливается определенное равновесие между содержанием фракционируемых молекул или ионов внутри гранул и в протекающей между ними жидкости — элюенте. При соответствующих изменениях состава элюента быстрее осуществляется «насыщение» внутреннего объема гранул связанными молекулами вещества или, наоборот, происходит полный выход этих молекул из гранул в ток элюента.
В обычной жидкостной хроматографии низкого давления используют сферические гранулы в широком диапазоне размеров (диаметром 20—300 микрон). Для обеспечения необходимой скорости протекания жидкости даже через длинные колонки с наиболее мелкими гранулами из этого диапазона достаточно создать перепад давления на колонке в 3-4 атмосферы. Процесс хроматографического фракционирования при этом занимает несколько часов.
С середины 70-х годов, когда открылись перспективы хроматографического контроля за технологическими процессами в пищевой и фармакологической промышленности, в интересах ускорения такого контроля многие фирмы стали пробовать переходить на размеры гранул в 10,5 и даже 3 мкн. Однако оказалось, что для обеспечения быстрого протекания элюента через колонки, наполненные столь мелкими гранулами, требуется создавать перепад давления в 200-300 атмосфер на колонку. Физически это можно объяснить двумя причинами. Во-первых, слои свободной жидкости между хорошо упакованными гидрофильными гранулами становятся так тонки, что начинает сильно сказываться жидкостное трение в элюенте. Во-вторых, столь малые гранулы трудно сделать сферическими и притом избежать как значительного разброса их диаметров, так и засорения промежутков между гранулами совсем мелкими обломками. («Отмучивание» в этих условиях малоэффективно.)