М е т о д К ь е л ь д а л я состоит в том, что органические азотосодержащие вещества подвергаются разрушению с помощью крепкой серной кислоты с применением катализатора и при нагревании. При этом углерод и водород органических соединений полностью окисляются до СО2 и Н2О за счет кислорода, освобождающегося при восстановлении серной кислоты. Азот органических веществ отщепляется в виде аммиака, который с серной кислотой образует сульфат аммония.
При помощи крепкой щелочи разлагают затем сульфат аммония и освободившийся при этом аммиак отгоняют и улавливают в титрованный раствор серной кислоты, который берется с избытком. Обратным титрованием определяют этот избыток, а отсюда делают вывод о количестве кислоты, связавшейся с аммиаком и о количестве азота сожженного вещества.
Д л я о п р е д е л е н и я к о л и ч е с т в а б е л к а в о б р а з ц е и с п о л ь з у е т с я р я д м е т о д и к :
1.Биуретовый метод
2.Микробиуретовый метод
3.Метод Бредфорда
4.Метод Лоури
5.Спектрофотометрический метод
Б и у р е т о в ы й м е т о д.Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков.
Интенсивность окраски раствора прямо пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически.
К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность.
М и к р о б и у р е т о в ы й м е т о д основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса, образующегося в результате взаимодействия пептидных связей с Cu2+ в щелочной среде. К 0,2 мл ПМ лимфоцитов, сыворотки или плазмы добавляли 3,5 мл раствора NаОН и 0,2 мл реактива Бенедикта. Выдерживали 15 мин при комнатной температуре и спектрофотометрировали на СФ — 46 при 330 нм. Построение калибровочного графика проводили по стандартному раствору белка.
М е т о д Б р э д ф о р д а один из наиболее популярных методов, используемый для определения концентрации белка в растворе. Метод определения концентрации белка по Брэдфорд успешно используется в случае измерения растворов с низкой концентрацией белка и растворов, содержащих компоненты, также обладающие значительным поглощением при 280 нм. Метод определения концентрации белка по Брэдфорд, так же, как и метод Лоури и BSA, требует построения стандартной калибровочной кривой перед измерением концентрации неизвестного белка.
Универсальность метода и его гибкость позволяют создавать модификации процедуры измерений для различных целей и типов измерений.
Метод Брэдфорд основан на сдвиге спектра поглощения кумасси (Coomassie Blue) в сторону значений 595 нм прямо пропорционально концентрации содержащегося в растворе белка. Кумасси образует комплекс с белком; этот комплекс измеряют при длине волны 595 нм. абсорбционная фотометрия комплекса кумасси / белок имеет очень высокую чувствительность и эффективна даже в случае следовых концентраций белков.
М е т о д Л о у р и. Метод количественного определения белка, основанный на измерении концентрации окрашенных продуктов, образующихся в результате сочетания двух химических реакций: биуретовой реакции на пептидную связь и взаимодействия реактива Фолина-Чокалтеу с ароматическими аминокислотами.
С п е к т р о ф о т о м е т р и ч е с к и й м е т о д. Спектрофотометрия (абсорбционная) — физико-химический метод исследования растворов и твёрдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200—400 нм), видимой (400—760 нм) и инфракрасной (>760 нм) областях спектра. Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии зависимость интенсивности поглощения падающего света от длины волны. Спектрофотометрия широко применяется при изучении строения и состава различных соединений (комплексов, красителей, аналитических реагентов и др.), для качественного и количественного определения веществ (определения следов элементов в металлах, сплавах, технических объектах).
2.3. Ускоренный метод определения белков в готовых блюдах и рационах
Для ускоренного определения белков в готовых блюдах и рационах В. А. Бабин и Н.Н. Мусерский разработали метод, представляющий модификацию метода, предложенного Джеремилло.
Сущность метода сводится к тому, что вещество, содержащее белки, минерализуется в металлической гильзе (медь, нержавеющая сталь, никель), которая герметически закрывается ввинчивающейся металлической пробкой с газоотводной трубкой, через которую газообразный аммиак и другие газы, образующиеся при минерализации, поступают в приемную колбу с серной кислотой.
Минерализация белков производится едким натром, растворенным в расплавленном уксусном натре при нагревании гильзы. Процесс минерализации белка происходит быстро ( в течении 2-3 минут) при температуре нагрева не выше 325ºС, что является преимуществом данного метода перед другими методами количественного определения белка.
3. КИСЛОТНЫЙ МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ ЖИРНОСТИ ПРОДУКТОВ
Рассмотрим данный метод на примере измерения жирности молока и молочных продуктов.
Метод основан на выделении жира из молока и молочных продуктов под действием концентрированной серной кислоты и изоамилового спирта с последующим центрифугированием и измерении объема выделившегося жира в градуированной части жиромера.
Чтобы определить содержание жира в молоке, освобождают жировые шарики от белковых оболочек. В качестве растворителя применяют концентрированную серную кислоту. Для более полного выделения освободившегося от оболочек жира употребляют изоамиловый спирт. При последующем центрифугировании смеси жир, как наиболее легкая составная часть, концентрируется в градуированной шкале стеклянного прибора — жиромера.
Если молоко исследуется вскоре после отбора, то его хорошо перемешивают, переворачивая до 6 раз закрытые бутылочки с пробами. При этом не допускают образования пены, которая приводит к неправильному отмериванию. Особенно тщательно подливают пробы долго стоявшего молока. Иногда их прогревают в воде, чтобы смыть жировой слой, приставший к стенкам бутылочки, а затем перемешивают.
В штатив устанавливают нужное количество пронумерованных жиромеров. Нумеруют жиромеры путем загибания вокруг шкалы жестяных пластинок с высеченными номерами.
В каждый жиромер отмеривают дозатором 10 мл серной кислоты. Потом отбирают пипеткой 10,78 мл (11 г) хорошо перемешанного молока. Осторожно, по стенке вливают молоко в жиромер. Во избежание преждевременного разогревания слой молока должен расположиться над слоем кислоты. При этом конец пипетки не должен касаться серной кислоты.
Отмеривают дозатором 1 мл изоамилового спирта, стараясь не смочить горлышко жиромера, что в последующем может привести к выскакиванию пробки.
Заполненные жиромеры закрывают резиновыми пробками и вставляют в центрифугу, привинчивают крышку центрифуги и центрифугируют 5 мин со скоростью около 1000 об/мин. По окончании центрифугирования жиромеры на 5 мин устанавливают пробками вниз в водяную баню при 65 °С.
4.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1. «Вопросы питания»,В. А. Бабин, Н.Н. Мусерский, 1958г;
2. «Методы исследований пищевых продуктов», А.И. Бурштейн,Киев 1963г;
3. «Мясная индустрия СССР», 1951г.
Интернет - источники:
1. http://dic.academic.ru;
2. http://ru.wikipedia.org/;
3. http://meddd.ru/;
4.http://tehstandart.com/;
5.http://pda./.