Благодаря образованию АТФ энергия, первоначально извлеченная путем окисления из углеводов и жиров, преобразуется в более удобную концентрированную форму химической энергии. В растворе, находящемся во внутриклеточном пространстве типичной клетки, имеется примерно 1 млрд. молекул АТФ, гидролиз которых до АДФ и фосфата обеспечивает необходимой энергией множество энергетически невыгодных реакций.
Самым важным этапом стадии 2 катаболизма является гликолиз – последовательность реакций, приводящих к расщеплению глюкозы. При гликолизе молекула глюкозы, содержащая 6 атомов углерода, превращается в 2 молекулы пирувата, содержащие по 3 атома углерода каждая. Для такого превращения требуется 9 последовательных ферментативных реакций, в которых происходит образование ряда промежуточных фосфатсодержащих соединений. (см. рисунок 1.)
Логически рассуждая, последовательность реакций гликолиза можно разделить на три этапа: 1) в реакциях 1-4 (см.рисунок 1) глюкоза превращается в трехуглеродный альдегид глицеральдегид-3-фосфат (для этого превращения нужны две фосфатные группы, а необходимая энергия выделяется при гидролизе АТФ); 2) в реакциях 5-6 альдегидная группа каждой молекулы глицеральдегид-3-фосфата окисляется до карбоксильной, и выделяющаяся при этом энергия расходуется на синтез АТФ из АДФ и Фн; 3) в реакциях 7-9 те две молекулы фосфата, которые присоединились к сахару на первой стадии, переносятся обратно на АДФ, в результате чего образуется АТФ и компенсируются затраты АТФ на этапе 1.
Рисунок 1. Промежуточные продукты гликолиза.[1,1994]
Суммарный выход энергии при гликолизе сводится к синтезу двух молекул АТФ (на одну молекулу глюкозы), которые образовались в реакциях 5 и 6. Таким образом, данные реакции имеют решающее значение для гликолиза. Эти две реакции – единственные во всем процессе, в которых из Фн формируется высокоэнергетическая фосфатная связь. Суммарным результатом этих двух реакций является окисление сахарного альдегида в фосфоглицероловую кислоту, перенос Фн на АДФ с образованием высокоэнергетической связи АТФ и восстановления НАД+ до НАДН.
Для большинства клеток животных гликолиз предшествует стадии 3 катаболизма, т.к. образующаяся при гликолизе молочная кислота быстро поступает в митохондрии, где окисляется до СО2 и Н2О. Тем не менее у анаэробных организмов и тканей, способных работать в анаэробных условиях, гликолиз может стать основным источником клеточного АТФ. В этих случаях молекулы пирувата остаются в цитозоле и превращаются в лактат, который затем выводится из клетки. Дельнейшее превращение пирувата в этих энергодающих реакциях, называемых брожением, требуется для того, чтобы полностью использовать восстановительный потенциал, полученный в реакции 5 гликолиза, и таким путем регенерировать НАД+, необходимый для дальнейшего осуществления гликолиза.[1,1994]
Окислительное фосфорилирование.
Окислительное фосфорилирование позволяет аэробным организмам улавливать значительную долю потенциальной свободной энергии окисления субстратов. Возможное объяснение механизма окислительного фосфорилирования предлагает хемиосмотическая теория. Ряд лекарственных веществ (например, амобарбитал) и ядов (цианид, окись углерода) подавляют окислительное фосфорилирование, обычно с фатальными последствиями. Окислительное фосфорилирование является столь жизненно важным процессом, что нарушение его нормального хода несовместимо с жизнью. Этим можно объяснить, почему обнаружено лишь небольшое количество генетических нарушений, затрагивающих эту систему.
Хотя цикл лимонной кислоты составляет часть аэробного метаболизма, ни в одной из реакций этого цикла, приводящих к образованию НАДН и ФАДH2, молекулярный кислород не принимает прямого участия; это происходит только в завершающей серии катаболических реакций, протекающих на внутренней мембране. Почти вся энергия, получаемая на ранних этапах окисления от сжигания углеводов, жиров и других питательных веществ, вначале запасается в форме высокоэнергетических электронов, переносимых НАДН и ФАДН. Затем эти электроны взаимодействуют с молекулярным кислородом в дыхательной цепи. Taк как большое количество высвобождаемой энергии используется ферментами внутренней мембраны для синтеза АТФ из AДФ и Фн, эти последние реакции называют окислительным фосфорилированием.
Синтез АТФ в реакциях окислительного фосфорилирования, протекающих в дыхательной цепи, зависит от хемиосмотического процесса. Механизм этого процесса, впервые предложенный в 1961 году, позволил разрешить проблему, давно ставшую перед биологией клетки.
Раньше думали, что энергию для синтеза АТФ в дыхательной цепи обеспечивает такой же механизм, как и при субстратном фосфорилировании: предполагалось, что энергия окисления используется для образования высокоэнергетической связи между фосфатной группой и каким-то промежуточным соединением и, что превращение AДФ в АТФ осуществляется за счет энергии, выделяемой при разрыве этой связи. Однако, несмотря на интенсивные поиски, предполагаемый интермедиат не был обнаружен.
Согласно хемиосмотической гипотезе, вместо богатых энергией промежуточных продуктов существует прямая связь между процессами химическими («хеми...») и транспортными (осмотическими, от греческого osmos - толчок, давление) - хемиосмотическое сопряжение.
Хемиосмотическая гипотеза, предложенная в начале 60-х годов, включала четыре независимых постулата, касавшиеся функции митохондрий:
1. Митохондриальная дыхательная цепь, находящаяся во внутренней мембране, способна перемещать протоны; при прохождении электронов по дыхательной цепи происходит «откачивание» Н+ из матрикса.
2. Митохондриальный АТФ-синтетазный комплекс тоже перемещает протоны через внутреннюю мембрану. Поскольку этот процесс обратим, фермент может не только использовать энергию гидролиза АТФ для переноса Н + через мембрану, но при достаточно большом протонном градиенте протоны начинают «течь» через АТФ-синтетазу в обратном направлении, что сопровождается синтезом АТФ.
3. Внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для Н +, ОН- и вообще всех анионов и катионов.
4. Внутренняя митохондриальная мембрана содержит ряд белков-переносчиков, осуществляющих транспорт необходимых метаболитов и неорганических ионов.
При прохождении высокоэнергетических электронов, доставляемых НАДН и ФАДH2, по дыхательной цепи внутренней митохондриальной мембраны от одного переносчика к следующему высвобождается энергия, которая используется для перекачивания протонов (Н+) через внутреннюю мембрану из матрикса в межмембранное пространство. (см.рисунок 2)
Рисунок 2. Перенос протонов при участии АТФ-синтазной системы (модель Митчелла).[10,1993]
В результате на внутренней мембране создается электрохимический протонный градиент; энергию о6ратного тока протонов «вниз» по этому градиенту используется связанный с мембраной фермент АТФ-синтетаза, катализирующий образование ATФ из АДФ и Фн, т.е. завершающий этап окислительного фосфорилирования.
Редокс-цепь окислительного фосфорилирования.
Электроны переносятся с НАДН на кислород с помощью трех больших ферментных комплексов дыхательной цепи. Хотя механизмы извлечения энергии в дыхательной цепи и в других катаболических реакциях различны, в их основе лежат общие принципы. Реакция Н2 + 1/2 О2 ® Н2О разбита на много небольших «шагов», так что высвобождаемая энергия может переходить в связанные формы, а не рассеивается в виде тепла. Как и в случае образования АТФ и НАДH при гликолизе или в цикле лимонной кислоты, это связано с использованием непрямого пути. Но уникальность дыхательной цепи заключается в том, что здесь прежде всего атомы водорода расщепляются на электроны и протоны. Электроны передаются через серию переносчиков, встроенных во внутреннюю митохондриальную мембрану. Когда электроны достигают конца этой электронтранспортной цепи, протоны оказываются там же для нейтрализации отрицательного заряда, возникающего при переходе электронов на молекулу кислорода.
Проследим процесс окисления, начиная с образования НАДH - главного акцептора реактивных электронов, извлекаемых при окислении молекул питательных веществ. Каждый атом водорода состоит из одного электрона и одного протона. Каждая молекула НАДH несет гидрид-ион (водородный атом + добавочный электрон, Н:-), а не просто атом водорода. Однако из-за присутствия в окружающем водном растворе свободных протонов перенос гидрид-иона в составе НАДH эквивалентен переносу двух атомов водорода или молекулы водорода (Н:- + Н+ ® Н2).
Перенос электронов по дыхательной цепи начинается с отнятия гидрид-иона (Н:-) от НАДH; при этом регенерируется НАД+ , a гидрид-ион превращается в протон и два электрона (Н:- ® Н+ + 2е-). Эти электроны переходят на первый из более чем 15 различных переносчиков электронов в дыхательной цепи. В этот момент электроны обладают очень большой энергией, запас которой постепенно уменьшается по мере прохождения их по цепи. Чаще всего электроны переходят от одного атома металла к другому, причем каждый из этих атомов прочно связан с белковой молекулой, которая влияет на его сродство к электрону. Важно отметить, что все белки – переносчики электронов – группируются в три больших комплекса дыхательных ферментов, каждый из которых содержит трансмембранные белки, прочно закрепляющие комплекс во внутренней мембране митохондрии. Каждый последующий комплекс обладает большим сродством к электронам, чем предыдущий. Электроны последовательно переходят с одного комплекса на другой, пока наконец не перейдут на кислород, имеющий наибольшее сродство к электрону.