Большое количество данных о свойствах мембран и их регуляции собрано при изучении используемой в качестве модельной системы Escherichia coli. Обнаружено, что мембраны клеток Е. coli во многих отношениях напоминают мембраны термофильных организмов. Об этом говорят следующие особенности мембран E.coli: 1) соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, накапливающихся в результате подавления биосинтеза липидов, сильно зависит от температуры; например, фракция свободных жирных кислот из клеток, выращенных при 15°С, содержит в 10 раз больше ненасыщенных жирных кислот, чем фракция, полученная из клеток, выращенных при 43°С; 2) при повышении температуры липиды мембраны Е. coli обнаруживают фазовый переход из упорядоченного в неупорядоченное состояние; синтез мембран, содержащих менее одной трети нормального количества таких липидов, приводит к гибели клетки.
Термофилы способны контролировать физические свойства цитоплазматической мембраны, изменяя ее состав в ответ на изменение температуры. Однако этот общий механизм, действует также и у мезофила Е. coli. Таким образом, температурные границы оптимального функционирования мембраны, от которых, несомненно, зависит величина кардинальных температур роста организма, определяются характером химических модификаций веществ, входящих в состав мембраны. Как и в случае термостабильных по своей природе белков, найденных у облигатных и кальдоактивных бактерий, тонкий механизм (или механизмы), участвующий в стабилизации мембраны, остается пока неизвестным. Молекулярная основа регуляции фазового перехода липидов относится к одной из наиболее важных, но еще слабоизученных сторон функционирования мембраны.
2.1.2 Термостабильность макромолекул
Выделенные из термофильных организмов макромолекулы обнаруживают большую термостабильность, чем их аналоги из мезофилов. Такая повышенная термостабильность, свойственна всем макромолекулам клетки, включая ферменты главных метаболических путей, ферредоксин, рибосомы и флагеллин.
Большинство белков, выделенных из термофилов, относится к ферментам, которые гораздо более стабильны, чем их аналоги из мезофилов. Классическим примером служит фермент миокиназа, которая сохраняет активность после нагревания при температуре 100°С. У тетрамера авидина в присутствии биотина температура перехода в денатурированное состояние составляет 132°С. У фосфофруктокиназ С. pasteurianum и Е. coli температурный переход происходит приблизительно при 70 и 60°С соответственно. Таким образом, основное различие между белками мезофилов и термофилов заключается в том, что все белки термофилов должны функционировать при температурах развития этих организмов.
Определение температуры максимальной активности ферментов также указывает на их повышенную термостабильность, а потеря всей или большей части активности в результате превышения этой температуры на 10—15°С согласуется с представлением о денатурации белка.
Физико-химическая характеристика белков термофильных микроорганизмов показывает, что они во многом гомологичны соответствующим белкам мезофилов: термофильные белки имеют такое же содержание участков с альфа-спиральной конфигурацией и бета-структурой и такое же число гидрофобных групп, как и аналоги из мезофильных организмов. Но в отличие от белков мезофилов, которые обычно денатурируются при температуре ниже 60°С, термофильные белки при повышении температуры от комнатной до 55 или 60° претерпевают, небольшие конформационные изменения, не сопровождаемые денатурацией.
Термофильные белки чаще всего содержат большое число неполярных боковых цепей, поэтому в результате стабилизации дополнительными гидрофобными взаимодействиями возникает повышенная термостабильность таких участков термофильных белков.
Термофильные белки более устойчивы к индуцируемой нагреванием агрегации, что следует из большей устойчивости к тепловой коагуляции цитоплазматических белков термофильных бактерий по сравнению с аналогичными белками мезофильных бактерий. Более низкая способность белков к агрегации связана с тенденцией к понижению изоэлектрических точек этих белков и повышению устойчивости их молекул к развертыванию, благодаря чему неполярные участки остаются скрытыми в глубине молекул
Термостабильность белков обусловлена также более низким содержанием цистеина и особенно вспомогательных сульфгидрильных групп, которые обычно располагаются на поверхности белка и поэтому легко подвергаются окислению.
Также известно, что ионы кальция могут стабилизировать ферменты не только у термофильных, но и у мезофильных организмов, и абсолютно необходимы для термостабильности. Образование дополнительных центров связывания кальция в случае термолизина и альфа-амилазы, очевидно, имеет отношение к повышенной термостабильности этих белков. Так, термостабильность термолизина при температурах приблизительно от 50 до 80°С повышается в результате стабилизации одного или двух участков ионами Са2+.
Степень стабильности белков также определяется специфическим положением в полипептидной цепи определенных аминокислот, поэтому огромное влияние на термостабильность молекулы белка может оказать замена в ней всего лишь одной аминокислоты в процессе различных мутаций генетического материала бактерии (Логинова Л.Г., 1977).
2.1.3 Небелковые стабилизирующие факторы
Некоторые ферменты, выделенные из термофилов, неустойчивы при оптимальной температуре роста данного организма. Это говорит о присутствии в клетках термофилов дополнительных стабилизирующих факторов. Такими факторами могут служить обычные клеточные компоненты, такие, как кофакторы, субстраты, мембраны и внутриклеточная среда, содержащая сильно заряженные макромолекулы, которые обеспечивают необходимую дополнительную стабилизацию ферментов.
Одним из самых наглядных примеров стабилизации фермента субстратом и модификаторами служит глутаминсинтетаза из В. stearothermophilus Этот фермент быстро теряет активность при 65°С, если в среде отсутствуют глутамат и ионы аммония. Глутаминсинтетаза стабилизируется также модификаторами, действующими по принципу обратной связи, особенно аланином, гистидином и ЦТФ. Для стабилизации внеклеточных гидролаз, например альфа-амилазы и термолизина требуется присутствие кальция. Для термостабильности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы В. coagulans необходимо наличие сильно заряженной окружающей среды.
2.1.4 Высокозаряженные макромолекулы внутри клеток
Термофильные бактерии синтезируют белки, которые обладают присущей им самим термостабильностью. Как отмечалось выше, многие ферменты, выделенные из облигатных или кальдоактивных бактерий, не являются стабильными при оптимальных и (или) максимальных температурах роста, хотя, несомненно, они более термостабильны, чем их мезофильные аналоги. Однако при изучении клеточных стенок факультативного термофила В. coagulans было показано, что отдельные гликолитические ферменты в неочищенных экстрактах этого организма, выращенного при 37 и 55°С, так же лабильны, как и ферменты из мезофильных организмов. Функциональным механизмом термофилии у факультативного термофила В. coagulans служит заряд внутриклеточных макромолекул, что подтверждается наличием у этого организма термолабильной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.
Заряженная внутриклеточная среда также имеет важное значение для выживания облигатных и кальдоактивных термофилов благодаря тому, что она может стабилизировать некоторые ферменты, обнаруживающие более низкую термостабильность при оптимальной или максимальной температуре роста.
Концепция стабилизации белков in vivo посредством заряженных макромолекул принята в качестве правдоподобного объяснения механизма термофилии у В. coagulans по следующим причинам:
1) в неочищенных экстрактах клеток, выращенных при любой из двух указанных температур, присутствуют заряженные макромолекулы, которые, однако, из-за разбавления в условиях in vitro не могут полностью проявить своего защитного действия на ферменты. Тем не менее имитация существующей в условиях in vivo заряженной среды путем добавления к клеточным экстрактам (NH4)2S04 или NaCl приводит к полному предохранению фермента от инактивации;
2) в случае очищенной до кристаллического состояния ГФДГ, т. е. в условиях, когда отсутствует взаимодействие фермента с другими макромолекулами, заряд сам по себе стабилизирует фермент;
3) микробная клетка представляет собой высокоорганизованную систему, содержащую лишь незначительное количество свободной внутриклеточной воды, таким образом высокозаряженные макромолекулы играют важную роль в механизме термостабилизации белков в интактной клетке. В условиях in vivo заряд макромолекул достаточен для стабилизации относительно термолабильных ферментов облигатных и кальдоактивных бактерий (Кашнер Д.,1981)
3. МЕХАНИЗМЫ ВЫЖИВАНИЯ БАКТЕРИЙ ПРИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ЗНАЧЕНИЯХ РН
Давно установлено, что концентрация водородных ионов играет роль фактора, определяющего границы существования живой матери, и является одним из важнейших факторов, влияющих на рост и размножение микроорганизмов. Концентрация водородных ионов воздействует на ионное состояние, а следовательно, и на доступность для организма многих метаболитов и неорганических ионов: с одной стороны, концентрация ионов водорода непосредственно влияет на клетку, ее электрический заряд, состояние мембраны, возможность протекания окислительно-восстановительных реакций, с другой стороны, — косвенно, определяя ионное состояние металлов, кислот, их доступность и токсичность. Невозможно переоценить ее влияние на стабильность и функции макромолекул в биологических процессах. Значения реакции среды различных природных вод и растворов, где развиваются микроорганизмы (от рН 1 — 2 в кислых источниках и рудничных стоках до рН 10 в содовых озерах), покрывают почти весь теоретически возможный диапазон значений рН (0— 14). Большая часть организмов наилучшим образом развивается при концентрации ионов водорода, близкой к рН=7, что характерно для многих природных сред. Очень высокие (кислая реакция) или очень низкие (щелочная реакция) концентрации водородных ионов обычно токсичны для большинства организмов. В общем, предельные концентрации ионов водорода, выше и ниже которых известные в настоящее время организмы прекращают рост и размножение, приблизительно равны рН=1, что отмечено лишь для немногих бактерий и грибов, и рН=11, что наблюдается в случае некоторых водорослей, грибов и бактерий. Большинство организмов живет при рН от 4 до 9, причем их оптимальный рост наблюдается в среде, близкой к нейтральной.