Пластинку с закрепленным сорбентом помещают в камеру, содержащую растворитель, и проявляют восходящей хроматографией. После того как фронт растворителя почти достигнет верхнего края, пластинку вынимают из камеры и сушат. Для получения двумерной хроматограммы высушенную пластинку можно повторно хроматографировать под прямым углом в другом растворителе. Положение пятен, как и при хроматографии на бумаге, определяют по окраске, по флуоресценции или при опрыскивании различными реагентами, которые реагируют с веществами в пятне с образованием окрашенных продуктов. Обычно используют следующие реагенты: нингидрин для аминокислот, родамин В для липидов, хлорид сурьмы для стероидов и терпенов, серную кислоту с последующим нагреванием практически для всех органических соединений (происходит обугливание), перманганат калия в серной кислоте для углеводородов, анисовый альдегид в серной кислоте для углеводов, пары брома для олефинов и т.д. Вещества можно элюировать путем соскребания.
ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ, жидкостная хроматография, основанная на разл. способности разделяемых ионов к ионному обмену с фиксир. ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп последнего. Для разделения катионов используют катиониты, для разделения анионов - аниониты (см. Иониты). Элюентом в первом случае служит р-р кислоты, во втором - р-р щелочи. Разделение ионов регулируют подбором оптим. значений рН элюента. Сильнокислотные сульфокатиониты и высокоосновные аниониты могут использоваться при любых значениях рН, слабокислотные карбоксильные катиониты - только при рН > 6; слабоосновные аниониты находятся в ионизованном состоянии при рН < 8. Варьируя рН элюента, можно резко изменять степень ионизации компонентов разделяемой смеси (сорбатов) и, следовательно, время их удерживания, добиваясь необходимой селективности разделения. Многозарядные ионы удерживаются ионитом сильнее однозарядных. При равных величинах зарядов удерживание падает с ростом радиуса гидратир. иона. Поэтому при И. х. в разб. р-рах на сульфокатионитах время удерживания катионов падает в ряду: Ва2+ > РЬ2+ > Sr2+ > Са2+ > Ni2+ > Cd2+ > Сu2+ > Со2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO2+ > Тl+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+. Для орг. ионов на электростатич. взаимод. с фиксир. зарядами ионита накладывается еще и гидрофобное взаимод. орг. части иона с матрицей ионита. Чтобы уменьшить его вклад в удерживание орг. ионов и добиться оптим. селективности их разделения, к водному элюенту добавляют орг. компонент (1-25% метанола, изопропанола, ацетонитрила или диоксана). Элюент в И. х. кроме к-ты или основания и орг. добавок может содержать нейтральный электролит, напр. NaNO3, ионы к-рого конкурируют с разделяемыми ионами за взаимод. с сорбентом; при этом удерживание однозарядных ионов падает пропорционально концентрации соли в р-ре, двухзарядных ионов - пропорционально ее квадрату. Важна также природа нейтрального электролита: чем выше сродство его ионов к сорбенту, тем выше элюирующая сила р-ра. В И. х. анионов часто используют фосфатные р-ры, к-рые обладают большой элюирующей способностью при высоких значениях рН, где фосфат приобретает заряд - 3. Мн. неорг. катионы разделяют на сульфокатионитах, используя в качестве элюента комплексообразователи (орг. к-ты или гидроксикислоты). Разделение основано на том, что константы устойчивости образующихся комплексов, а значит и их сорбционные св-ва, даже таких близких по св-вам катионов, как лантаноиды и актиноиды, при определенных значениях рН различаются достаточно сильно; при этом заряд комплекса можно менять (вплоть до отрицательного). С помощью И. х. разделяют нек-рые нейтральные соед., если они способны превращ. в заряженные комплексы, как, напр., комплексы углеводов с борат-ионом. Удерживание разделяемых ионов в колонке пропорционально обменной емкости ионита. Для используемых в И. х. полимерных ионитов емкость 3-6 мг-экв/г, для ионитов на основе силикагеля с привитыми к его пов-сти функц. группами - на порядок ниже. При равном размере зерен (обычно 5-15 мкм) иониты на основе силикагеля обладают более высокой скоростью ионного обмена, что повышает эффективность хроматографич. колонок, однако их гидролитич. устойчивость при рН / 8 недостаточна. Для увеличения эффективности (числа теоретич. тарелок) колонки с полимерными ионитами обычно используют при повыш. т-рах (50-80 °С); при этом увеличиваются коэф. диффузии ионов в фазе ионита. В качестве сорбентов для И. х. могут использоваться нейтральные носители, пропитанные жидкими ионитами, т.е. несмешивающимися с водой орг. основаниями или к-тами, напр., триоктиламином, триоктилметиламмонием, алкиловыми зфирами алкилфосфорной к-ты. Разбавленные р-ры ионогенных ПАВ в сочетании с нейтральными гидрофобными носителями находят применение в ион-парной хроматографии (см. Жидкостная хроматография),к-рая отличается высокой эффективностью и большим числом варьируемых параметров для подбора оптим. селективности разделения. Детектирование в И. х. осуществляют с помощью любого детектора, применяемого в жидкостной хроматографии (см. Детекторы хроматографические). Наиб. универсален для ионных соединений кондуктометр, на применении к-рого основан вариант И. х. - ионная хроматография.И. х. применяется для разделения катионов металлов, напр., смесей лантаноидов и актиноидов, Zr и Hf Мо и W, Nb и Та; последние разделяют на анионитах в виде анионных хлоридных комплексов в р-рах соляной и плавиковой к-т. Щелочные металлы разделяют на катионитах в водных и водно-орг. средах, щел. - зем. и редкоземельные металлы на катионитах в присут. комплексонов. Большое значение имеет автоматич. анализ смесей прир. аминокислот на тонкодисперсном сульфокатионите в цитратном буфере при повыш. т-ре. Аминокислоты детектируют фотометрически после их р-ции с нингидрином или флюориметрически после дериватизации фталевым альдегидом. Высокоэффективная И. х. (колонки, упакованные сорбентом с размером зерен 5-10 мкм, давление для прокачивания элюента до 107 Па) смесей нуклеотидов, нуклеозидов, пурияовых и пиримидиновых оснований и их метаболитов в биол. жидкостях (плазма крови, моча, лимфа и др.) используется для диагностики заболеваний. Белки и нуклеиновые к-ты разделяют с помощью И. х. на гидрофильных высокопроницаемых ионитах на основе целлюлозы, декстранов, синтетич. полимеров, широкопористых силикагелей; гидрофильность матрицы ионита уменьшает неспецифич. взаимод. биополимера с сорбентом. В препаративных масштабах И. х. используют для выделения индивидуальных РЗЭ, алкалоидов, антибиотиков, ферментов, для переработки продуктов ядерных превращений.
Хроматофокусирование - метод ионообменной хроматографии, использующий в качестве инструмента разделения градиент рН, формируемый в слое сорбента внутри колонки. Метод успешно применяют для разделения цвиттер-ионных биологических макромолекул [1-3]. Формирование внутреннего градиента рН в хроматофокусировании заключается в предварительном уравновешивании анионообменной хроматографической колонки стартовым раствором (СР) с высоким значением рН, содержащим слабое основание, и в последующем пропускании элюента с более низким рН, составленного из слабых органических кислот или амфолитов.
Предложен вариант хроматофокусирования переходных металлов, сочетающий принципы комплексообразовательной хроматографии с формированием нисходящего градиента рН внутри колонки, заполненной сорбентом с привитыми олигоэтиленаминами.
В основе этого варианта лежит образование аминных комплексов ионов металлов (например, Cu2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Cd2+, Fe3+, Cr3+, Mn2+, UO22+, Pb2+) при начальном значении рН 7,0 - 7,5 и их последующая диссоциация при линейном снижении рН до 3. Возможности метода продемонстрированы на примере концентрирования и разделения 4 - 5 ионов металлов из изученного ряда в вариантах хроматографии низкого давления и ВЭЖХ [4, 5]. На данный момент ведутся работы на карбоксильных катионообменных сорбентах.
Это связано с тем, что комплексообразование ионов металлов с олигоэтиленаминами является многоступенчатым процессом с медленной кинетикой. В случае с карбоксильными сорбентами, вероятно, удастся расширить круг ионов металлов, разделяемых в условиях формирования нисходящего градиента рН, включив в него щелочноземельные металлы. Отметим, что нисходящие градиенты рН внутри катионообменных колонок в хроматофокусировании ранее не получали.
АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (от лат. affinis - родственный) (биоспецифич. хроматография, хроматография по сродству), метод очистки и разделения белков, основанный на их избират. взаимод. с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем. В кач-ве лигандов используют соед., взаимод. к-рых с разделяемыми в-вами основано на биол. ф-ции последних. Так, при разделении ферментов (для чего преим. и применяется А. х) лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты. Главная особенность, к-рая обусловливает высокую эффективность А. х., состоит в том, что разделение основано на различии не физ. - хим. признаков молекулы (заряда, формы и размера), а специфич. функциональных св-в, отличающих данный фермент от множества др. биополимеров.
Неподвижная фаза в А. х. представляет собой специально получаемый сорбент, построенный обычно по схеме: носитель - соединяющее звено ("ножка") - специфич. лиганд. Носителем служит чаще всего сефарозапроизводное агарозы, имеющее поперечные сшивки. Присоединение к ней лиганда или "ножки", содержащих, как правило, аминогруппу, осуществляется после активации сефарозы бромцианом: