В конце 1970-х годов доктор Скотт организовал собственную компанию - Oculinum, Inc., где продолжил изучение токсина ботулизма типа А. В 1978 году доктор Скотт получил разрешение FDA (Управления по контролю за продуктами и лекарствами) на исследование использования ботулинического токсина типа А на людях-добровольцах.
В 1988 году компания Allergan приобрела права на распространение разработанного доктором Скоттом препарата Oculinum, основанного на токсине ботулизма типа А, и проведение клинических исследований эффективности препарата при других показаниях, включая цервикальную дистонию.
В 1989 году компания Oculinum, Inc. получила разрешение FDA на продажу препарата Oculinum в США, как препарата для лечения косоглазия и блефароспазма, включая идиопатический блефароспазм или нарушение VII нерва у пациентов в возрасте от 12 лет.
Вскоре после этого компания Allergan Inc. приобрела компанию доктора Скотта. На основе успешного применения токсина ботулизма типа А в лечении косоглазия и блефароспазма, связанных с дистонией, компания Allergan получила разрешение FDA на изменение названия препарата на BOTOX®. Эта замена названия отразила стратегию Allergan, касающуюся развития других областей применения препарата.
BOTOX® используется в России уже более 10 лет с момента его первой регистрации в 1994 году для лечения блефароспазма и гемифациального спазма. В течение последних 10 лет неизменно возрастало количество показаний для применения BOTOX®. В настоящее время они включают цервикальную дистонию, детский церебральный паралич, спастичность, возникшую в результате инсульта, и подмышечный гипергидроз.
Перед употреблением нейротоксин ботулизма проходит специальную очистку и связывается с альбуминами. Такая связь делает токсин более устойчивым, сохраняет его биологическую активность, обеспечивает локальное действие препарата. Нейротоксин блокирует передачу двигательного импульса с нерва на мышечное волокно. После введения препарата наступает выраженное расслабление мимических мышц. Атрофии мышц не наблюдается, так как их кровоснабжение остаётся прежним. В среднем максимум терапевтического эффекта проявляется на 14-15 день. Нейротоксин блокирует передачу импульса не только на мышцы, но и на потовые железы и, т.о., уменьшает потоотделение. Препараты успешно применяются для лечения повышенного потоотделения на ладонях, в подмышечных впадинах и на стопах.
Продолжительность действия составляет 6-9 месяцев, иногда — до 1 года. Подвижность мускулатуры частично восстанавливается через 3-4 месяца, полное восстановление наблюдается через 5-8 месяцев. После повторных инъекции продолжительность эффекта доходит до 6-12 месяцев. Для достижения стойкого и длительного эффекта рекомендуется введение препаратов 2-3 раза в течение года. При местном введении в терапевтических дозах ботулинический токсин типа А не вызывает системного (на весь организм) действия, продолжительность лечения им неограниченна.
Относительные противопоказания: миастения, нарушения свёртываемости крови, воспалительный и/или инфекционный процесс в областях предполагаемых инъекций, общие заболевания в стадии обострения, приём лекарственных средств (антибиотиков, антикоагулянтов, антиагрегантов, реланиума, баклофена), хронические обструктивные заболевания лёгких, беременность и период грудного вскармливания, возраст младше 12 лет, нежелательно проводить процедуру в первые дни менструального цикла.
Возможные осложнения, такие как обратимое опущение верхнего века(частота возникновения 0,14%), опущение бровей (менее 1%), двоение в глазах (2%), отёк век (0,14%), не связаны с самими препаратами, они могут возникнуть при неправильном выборе способа и места введения, неадекватной дозе или при несоблюдении стерильности. Важно помнить, что все они бесследно исчезают со временем. Побочные эффекты:болезненность в месте инъекции (частота возникновения 1,3%), головная боль (2%), кровоизлияния в месте введения (6%), онемение в месте инъекции (менее 1%), аллергия (менее 1%). Нечувствительность к нейротоксину встречается редко (менее 0,1%) (www. BOTOX.com).
Род Clostridium включает анаэробные, грамположительные спорообразующие палочки, широко распространенные во внешней среде. Они обнаруживаются в почве, отложениях морских и пресных вод, кишечном тракте людей и животных. Представители рода могут быть патогенны для человека и животных, вызывая раневую инфекцию или кишечные заболевания, однако находят и практическое применение в промышленности (в парфюмерной промышленности, для получения в промышленном масштабе ацетона и бутанола), в медицине (для лечения блефароспазма, гемифациального спазма, цервикальной дистонии, детского церебрального паралича, спастичности, возникшей в результате инсульта, и подмышечного гипергидроза). Описано много видов, их количество в настоящее время превышает 100, однако многие из них остаются слабо изучены (Пивоваров, 2000).
Глава 2. Объекты и методы исследований
2.1 Объекты исследования
Использовались различные объекты, такие как почва из ясеневого леса и поля, растительные волокна, а также пищевые продукты, а именно консервы: килька в томатном соусе и баклажанная икра.
2.2 Выявление мезофильных анаэробных микроорганизмов
(ГОСТ 10444.4)
Метод предназначен для определения стерильности и промышленной стерильности консервов, для выяснения причин возникновения дефектов консервов.
Проведение анализа. Для выявления анаэробных микроорганизмов посев производится в две пробирки со средой Китта-Тароцци с добавлением 0,15% агара. Непосредственно перед посевом агаризованную (полужидкую) среду Тароцци прогревают 25 мин в кипящей водяной бане и затем быстро охлаждают до температуры 30-40°С. Засеянные пробирки помещают в термостат. Термостатирование посевов консервов с рН выше 4,4 проводят при 37±0,5°С, контролируя ежедневно в течение 5 суток появления в них признаков роста микроорганизмов. Развитие мезофильных анаэробных микроорганизмов в посевах сопровождается помутнением среды, выделением газа, появлением посторонних запахов (гнилостный, сырный, маслянокислый), в некоторых случаях разложением печени, реже почернением среды.
Муть появляется почти по всей толще столбика, иногда отступая от его поверхности на 0,5 – 1,0 см. в дальнейшем клетки мезофильных анаэробных микроорганизмов оседают на дно и помутнение может исчезнуть.
При исследовании под микроскопом мазков из культуры 18-24 возраста можно обнаружить палочки, положительно окрашивающиеся по Грамму и образующие споры. Количество палочек со спорами невелико, а при выявлении Cl. perfringens споры обычно отсутствуют. Для подтверждения принадлежности выявленных спорообразующих микроорганизмов к мезофильным облигатным анаэробам из рода клостридиум проверяют отсутствие в них каталазы. Если в посевах обнаружены спорообразующие грамположительные микроорганизмы, но каталаза не выявлена, то анализ на выявление прекращают и считают, что в посевах присутствуют мезофильные облигатно-анаэробные микроорганизмы из рода клостридиум.
Если при микроскопировании посевов спорообразующие микроорганизмы не обнаружены, то отрицательная проба на каталазу не является достаточной для заключения о присутствии в посевах мезофильных облигатно-анаэробных микроорганизмов и анализ продолжают. Анализ на выявление мезофильных облигатно-анаэробных микроорганизмов продолжают в случае присутствия в посевах смешанной микрофлоры и положительной пробы на каталазу.
После появления признаков роста. из посевов 1 мл переносят в стерильную пробирку и заливают расплавленным агаром температурой не более 45 °С. Пробирку заливают до верха и закрывают пробкой так, чтобы не осталось пузырьков воздуха. Посевы термостатируют 24-48 часов при 37 ± 0,5°С. При обнаружении разрывов в агаре считают, что в посеве присутствуют мезофильные облигатно-анаэробные микроорганизмы (методическое указание, АГТУ,1998).
2.3. Выявление термофильных анаэробных микроорганизмов
( ГОСТ 10444.6)
Метод предназначен: для определения стерильности или промышленной стерильности консервов, предназначенных к реализации в условиях с температурой 30°С и выше; для выяснения причин возникновения дефектов томатопродуктов и консервов с рН выше 4,6.
Сущность метода: выявление в консервах жизнеспособных термофильных анаэробных микроорганизмов размножаться при температуре 55 °С и давать рост на жидких питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом. В жидких питательных средах Cl. termosaccharolyticumвызывает обильное газообразование, помутнение среды и ее подкисление.
Проведение анализа. Непосредственно перед посевом питательную среду (Китт-Тароцци) регенерируют, прогревая ее 25 мин в кипящей водяной бане и быстро охлаждая до 40 °С.
Для установления промышленной стерильности и при выявлении возбудителей порчи по 2 см3 пробы высевают в две пробирки с 12-13 см3 регенерированной питательной среды (стерильности по 30 см3 в три флакона с 200 см3 питательной среды).
Посевы термостатируют при 55 ±0,5°С в течение 72 часов. Рост уже обнаруживается через 12-14 часов. После появления признаков роста из посевов приготавливают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют.
Термофильные анаэробные микроорганизмы – тонкие длинные гранулированные палочки, которые нерегулярно образуют споры. Окраска по Грамму отрицательная у Cl. termosaccharolyticum, положительная у Cl. termoaceticumиCl. nigrificans. Из посевов со дна берут пробу дя определения каталазы.
Если в культуре обнаружена каталаза, то в посеве присутствуют аэробные микроорганизмы. Для выделения из смешанной микрофлоры 1-2 мл подозреваемой культуральной жидкости вносят в стерильную пробирку и заливают расплавленным агаром с температурой не выше 47 °С. Пробирку заливают агаром доверха и закрывают пробкой, чтобы не осталось пузырьков воздуха. При обнаружении в агаре разрывов делают заключение о наличии термофильных анаэробов (методическое указание, АГТУ,1998).