В плазме крови имеется большое количество других соединений, способных взаимодействовать с АКМ и тормозящих развитие свободнорадикальных реакций посредством хелатирования ионов переменой валентности. К ним относятся железосвязывающие белки: ферритин, гемосидерин и трансферрины; медьсвязывающий фермент церулоплазмин; молочная и мочевая кислот; некоторые пептиды, гормоны и гормоноподобные вещества [11].
Таким образом, учитывая ведущую роль в патогенезе атеросклеротических повреждений процессов окислительной модификации ЛП, весьма интересным представляется изучение влияния пищевых АО (особенно жирорастворимых) в условиях гиперхолестеринемии, сопровождающейся окислительным стрессом, на атерогенез. Не менее важным представляется проанализировать комплексное воздействие эссенциальных жирных кислот класса Омега-6, Омега-3 и АО, так как известно, что ПНЖК являются быстроокисляемым субстратом (т.е. могут провоцировать развитие антиоксидантной системы), с одной стороны, и незаменимыми регуляторами состояния эндотелия, тонуса сосудов и процессов свертывания крови (т.е. могут препятствовать развитию антиоксидантной системы), с другой стороны.
Изучение антиатеросклеротического действия СМЛР выполнено в эксперименте на животных в общепринятой модели. Эксперимент проведен на 30 половозрелых белых крысах-самцах Вистар весом 270-410 г. В зависимости от условий эксперимента животные были разделены на 3 равные по численности группы: контрольную и две опытные.
Таблица 1
Состав экспериментальных рационов
| Наименование | Рацион (количество в г.) | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| Казеин | 197 | 197 | 197 | 197 |
| Метионин | 3 | 3 | 3 | 3 |
| Крахмал | 445 | 445 | 280 | 280 |
| Сахар | 175 | 175 | 175 | 175 |
| Отруби | 50 | 50 | 50 | 50 |
| Масло подс. контр.* | 45 | 35 | 10 | - |
| Холина хлорид | 5 | 5 | 5 | 5 |
| Солевая смесь** | 70 | 70 | 70 | 70 |
| Витаминная смесь*** | 10 | 10 | 10 | 10 |
| Холестерин | - | - | 10 | 10 |
| СМЛР**** | - | 10 | - | 10 |
| Масло окисленное***** | - | - | 190 | 190 |
* масло в 45 г содержит: ретинола ацетата 15000 МЕ, эргокальциферола – 500 МЕ
** состав солевой смеси представлен в таблице 2
*** в 1 г содержит: тиамина (В1) – 0,6 мг, рибофлавина (В2) – 0,6 мг, пиридоксина (В6) – 1,5 мг, никотиновой кислоты – 3,0 мг, пантотената кальция – 1,6 мг, фолиевой кислоты – 1,0 мг, цианкобаламина (В12) – 0,003 мг, викасола – 0,1 мг, Д-биотина – 0,02 мг, токоферола ацетата – 15 мг, глюкозы – до 1 г.
**** - СМЛР содержит (г/100 г): нерафинированное масло льна – 14,3 , нерафинированное масло расторопши – 85,7, селена - 0,001 в составе селенопирана, жирнокислотный состав см. в таблице 3
***** - масло окисленное в 200 г содержит: ретинола ацетата 15000 МЕ, эргокальциферола – 1500 МЕ
Таблица 2
Состав солевой смеси
| № | Название соли | Химическая формула | Количество, г |
| 1 | Хлористый натрий | NaCl | 139,3 |
| 2 | Калий фосфорнокислый, однозамещенный | KH2PO4 | 388,8 |
| 3 | Магний сернокислый | MgSO4 | 57,4 |
| 4 | Кальций углекислый | CaCO3 | 380,4 |
| 5 | Железо сернокислое | FeSO4*7H2O | 26,4 |
| 6 | Калий йодистый | KI | 0,77 |
| 7 | Марганец сернокислый | MnSO4*7H20 | 4,55 |
| 8 | Цинк сернокислый | ZnSO4*7H2O | 0,53 |
| 9 | Медь сернокислая | CuSO4*5H2O | 0,48 |
| 10 | Кобальт хлористый | CoCl2*6H2O | 0,024 |
| 11 | Натрий фтористый | NaF | 0,50 |
| 12 | Алюмокалиевые квасцы | K2SO4Al2(SO4)3*24H2O | 0,11 |
| ИТОГО | 1000 |
На первом этапе эксперимента (14 дней) животные контрольной группы и первой опытной группы получали рацион, содержащий (по калорийности) 20% белка (казеин), 70% углеводов, 10% жиров (подсолнечное масло) (таблица 1, рацион 1). Животные второй опытной группы получали рацион с замещением части жира СМЛР (таблица 1, рацион 2). Витамины и минеральные вещества добавляли в соответствии с физиологическими нормами (таблица 1 и таблица 2). Корм животным давали вволю, доступ к воде был свободным.
На втором этапе эксперимента (28 дней) животные контрольной группы получали рацион 1, животные опытных групп получали высокожировой рацион (ВЖР), содержащий 10 г/кг холестерина и 40% жиров по калорийности (подсолнечное масло, перекисное число которого составляло 38 ммоль активного кислорода на 1 кг продукта). В первой опытной группе 5% жира замещали обычным (неокисленным) подсолнечным маслом (таблица 1, рацион 3), во второй опытной группе – СМЛР (таблица 1, рацион 4).
Таблица 3
Жирнокислотный состав смеси масел льна и расторопши (СМЛР)
| Наименование | Количество, % |
| Сумма насыщенных жирных кислот | 13,71 |
| Сумма мононенасыщенных жирных кислот | 27,39 |
| Сумма ПНЖК, из них: | 58,99 |
| Линолевая (w-6) С18:2 | 50,1 |
| g-линоленовая (w-6) С18:3 | 0,03 |
| a-линоленовая (w-3) С18:3 | 8,86 |
| Соотношение w-6/w-3 | 5,66 |
2.2. ПОДГОТОВКА БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ БИОХИМИЧЕСКОГО И ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
После окончания эксперимента животных выдерживали 12 часов без корма, затем наркотизировали тиопенталом натрия в дозе 6 мг на 100 г веса. После чего вскрывали брюшную полость, пунктировали брюшную аорту и собирали кровь в пробирки с гепарином, центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Готовые гемолизаты эритроцитов (разведение 1:1) и плазму затем замораживали и хранили при – 18°С- – 20°С до исследования. Затем перфузировали печень insituчерезсоустье полой вены охлажденным физиологическим раствором. Далее извлекали печень, промывали охлажденным физраствором, продавливали через металлический пресс с диаметром отверстий 0,2 мм и готовили гомогенаты. Печень гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвейма с тефлоновым пестиком (зазор 0,18-0,2 мм) в течение 90 с при 1200 об/мин. Гомогенат хранили при –18°С- – 20°С.
Для гистологического исследования брали грудной и брюшной отдел аорты. Аорту фиксировали 10% формалином, вскрывали по длине, проводили макроскопическое исследование, далее готовили срезы методом парафиновой проводки, окрашивали гематоксилином + эозином, проводили микроскопическое исследование
Изучение антиоксидантных свойств СП invitro проводили в системе нерафинированных растительных масел: подсолнечного, смеси масел льна и расторопши пятнистой. В модельной системе с подсолнечным маслом для сравнения использовали бутилокситолуол (БОТ) и ТФ. При этом концентрация АО (в том числе и СП) составляла 0,01% от массы. Контролем служило чистое масло. Окисление проводили при температуре 80 С, пропуская через масло воздух со скоростью 5 л/ч. Автоокисление смеси масел льна и расторопши (1:6, v/v) проводили в мягких условиях – при комнатной температуре без принудительного пропускания воздуха. СП или ТФ добавляли в смесь масел в концентрации 0,005%. Контролем служила смесь масел без АО. Количество пероксидов определяли йодметрическим титрованием [ГОСТ 26593-85].
Метод основан на окислении йодистого калия перекисями и гидроперекисями, содержащимися в образце, в растворе уксусной кислоты и хлороформа и титровании выделившегося йода раствором тиосульфата натрия.
Пробу отвешивают в колбу или пробирку, помещают навеску в колбу. Добавляют 10 см3 хлороформа, растворяют навеску, приливают 15 см3 уксусной кислоты и 1 см3 раствора йодистого калия, колбу сразу же закрывают, перемешивают содержимое в течение 1 мин и оставляют на 5 мин в темном месте при температуре 15-25°С. Затем добавляют 75 см3 воды, тщательно перемешивают и добавляют пять капель раствора крахмала. Выделившийся йод титруют раствором тиосульфата натрия, используя раствор следующей концентрации в зависимости от предполагаемого значения перекисного числа. С (½Na2S2O3) = 0,002 моль\дм3 , если перекисное число не более 6,0 моль\кг или с (½Na2S2O3) = 0,01 моль\дм3, если перекисное число равно или более 6,0 моль\кг [Издательство стандартов, 1994]. Массу пробы, необходимой для измерений, в зависимости от предполагаемого перекисного числа определяют по таблице:
| Предполагаемое значение перекисного числа, моль\кг | Масса испытуемой пробы, г |
| От 0 до 6,0 | 5,000-2,000 |
| От 6,0 до 10 | 2,000-1,200 |
| От 10,0 до 15,0 | 1,200-0,600 |
| От 15,0 до 25,0 | 0,600-0,500 |
| От 25,0 до 40,0 | 0,500-0,300 |
Для каждой испытуемой пробы выполняется два измерения. Контрольные измерения проводят параллельно с основными измерениями. Если на контрольное измерение пойдет более 0,1 см3 (0,01 моль\дм3) раствора тиосульфата натрия, то проверяют соответствие реактивов стандарту.