РОЗДІЛ 2. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ МІТОХОНДРІЙ
Значних успіхівбуло досягнуто у вивченні мітохондрій, при цьому значну роль зіграла електронна мікроскопія, яка дала можливість виявити їх специфічну ультраструктурну організацію, а також розробка методів біохімічного аналізу цих органоїдів після виділення.
Електронна мікроскопія. Взаємозв'язок довжини хвилі світла і межі дозволу зберігається для будь-якої форми випромінювання, як для світлових променів, так і для електронів. Однак в останньому випадку межа дозволу істотно нижче. Довжина хвилі електрона зменшується зі збільшенням його швидкості. В електронному мікроскопі з напругою 100000 В довжина хвилі електрона дорівнює 0.004 нм, а відповідно до теорії, дозвіл такого мікроскопа складає 0,002 нм.
Загальна схема просвічуючого електронного мікроскопа (ПЕМ). Джерело випромінювання - нитка катода, яка випускає електрони з вершини циліндричної колони висотою біля двох метрів. Оскільки при зіткненні з молекулами повітря електрони розсіюються, у колоні повинний бути створений вакуум. Електрони, які випромінюються катодною ниткою, прискорюються найближчим анодом і проникають через малюсінький отвір, формуючи електронний промінь, який проходить у нижню частину колони. Уздовж колони на деякій відстані розташовані кільцеві магніти, які фокусують електронний промінь, подібно скляним лінзам, які фокусують промінь світла у світловому мікроскопі. Зразок через повітряний шлюз поміщають у вакуум колони, на шляху електронного пучка. Частина електронів у момент проходження через зразок розсіюється відповідно до щільності речовини в даній ділянці, залишок електронів фокусується й утворить зображення на фотопластинці або на фосфоресцируючому екрані.
В електронному мікроскопі не можна спостерігати живі об'єкти. Тому тканини фіксують, зшиваючи клітини і клітинні структури глутаральдегідом, а потім обробляють осмієвою кислотою. Зразки збезводнюють, фіксують смолами і нарізають тонким скляним або алмазним ножем.
Тонкі зрізи практично є двовимірними зрізами тканини і не дозволяють судити про тривимірну структуру клітинних компонентів. Тривимірне зображення можна одержати після реконструкції сотень серійних зрізів. В даний час розроблені більш прямі методи одержання тривимірного зображення. Один з них складається у вивченні зразка під скануючим електронним мікроскопом. Для одержання зображення в просвітчастому електронному мікроскопі використовують електрони, які проходять через зразок, а в скануючому електронному мікроскопі використовуються електрони, які розсіюються або випромінюються поверхнею зразка. У даному випадку зразок повинен бути зафіксований, висушений і покритий тонкою плівкою важкого металу. Потім зразок сканується дуже вузьким пучком електронів. У такий спосіб відбувається формування єдиного, цільного і значно збільшеного зображення.
Метод скануючої електронної мікроскопії забезпечує значну глибину фокусування; більш того, оскільки масштаби розсіювання електронів визначаються кутом поверхні стосовно променя, на зображенні виникають світлі і темні ділянки, які чергуються та створюють враження тривимірності. Але цей метод застосовують тільки для вивчення поверхні і його дозвіл порівняно невеликий (близько 10 нм з ефективним збільшенням приблизно 20 тис. раз). Даний метод практично не застосовується для вивчення субклітинних органел і використовується винятково для вивчення цілих кліток і тканин.
Просвітлюючий електронний мікроскоп можна використовувати для вивчення поверхні зразка з дуже великим збільшенням, спостерігаючи окремі макромолекули. На висушений зразок напиляється тонка плівка важкого металу. Метал напиляється під певним кутом, так що відкладення напиленої плівки в деяких місцях товстіше, ніж в інших. Цей процес відомий як відтінення, при ньому виникає ефект тіні, який створює враження тривимірності зображення.
Приготовані в такий спосіб зразки можуть бути досить малі і тонкі, щоб електронний промінь проникав крізь них; наприклад, таким способом можна аналізувати індивідуальні молекули, віруси і стінки кліток. Що ж стосується більш товстих зразків, то тут після відтінення необхідно видалити органічний матеріал клітки, при цьому на поверхні зразка залишиться тільки тонкий металевий відбиток або репліка поверхні. Ця репліка потім підсилюється вуглецевою плівкою, після чого її можна помістити на сітку і вивчати в звичайному електронному мікроскопі.
У клітинній біології особливо успішно використовуються два методи, засновані на одержанні механічних реплік. Один з них - метод електронної мікроскопії «заморожування-сколювання» - дає можливість вивчати внутрішню будову клітинних мембран. Клітки заморожують при температурі рідкого азоту. Заморожений блок потім розколюють лезом ножа. Відкол часто проходить через гідрофобну середину подвійного шару ліпідів, оголюючи внутрішню поверхню клітинних мембран. Утворену поверхню відколу, яка утвориться відтіняють платиною, органічний матеріал видаляють і вивчають отримані репліки в електронному мікроскопі.
Метод «заморожування - травлення»використовується для вивчення зовнішньої поверхні кліток і мембран. У даному випадку клітки заморожують при дуже низькій температурі і замороженому блоці розколюють лезом ножа. Вміст льоду навколо кліток (і в меншому ступені усередині кліток) знижують сублімацією води у вакуумі при підвищенні температури (процес називають вакуумним сушінням). Ділянки клітини, піддані такому травленню, потім відтіняють для готування платинової репліки.
Використовуючи для контрастування відтінення солями важких металів, можна спостерігати в електронний мікроскоп ізольовані макромолекули, наприклад, ДНК або великі білки, а після негативного контрастування можна розгледіти навіть дрібні деталі. При готуванні зразків для негативного контрастування досліджувані молекули наносять на тонку плівку вуглецю (практично прозору для електронів), потім її змочують концентрованим розчином солей важких металів, наприклад, уранілацетата. Після висушування зразка тонка плівка солей важких металів рівномірно покриває вуглецеву підкладку, за винятком ділянок, зайнятих адсорбованими макромолекулами. Речовина макромолекул більш проникна для електронів у порівнянні з ближніми ділянками, покритими солями важких металів; за рахунок цього виникає звернене або негативне зображення молекули.
В даний час можна спостерігати з високим дозволом навіть внутрішні деталі тривимірних структур, таких, як віруси. Для цього використовують метод кріоелектроної мікроскопії,де дуже тонкий (приблизно 100 нм), швидко заморожений шар вологого зразка поміщають на мікроскопічні ґрати. За допомогою спеціального пристосування гідратований зразок утримують при - 160сС у вакуумі мікроскопа. Таким способом можна спостерігати матеріал практично безпосередньо: без фіксації, фарбування і сушіння.
При біохімічному аналізі використовують такі методи дослідження, як гібридизація, імуноцитохімія з застосуванням моноклінних антитіл на електронно-мікроскопічному рівні. За допомогою біохімічних методів вивчали АТФ-синтетазні комплекси внутрішньої мембрани.
Хоча дослідження мітохондрій у живій клітині пов'язано з відомими труднощами через те, що вони мають низький показник переломлення, їх усе-таки можна легко спостерігати в культурах тканини in vitro, зокрема під фазово-контрастним мікроскопом або в темному полі звичайного мікроскопа.
При фазово-контрастному та інтерференційному мікроскопуванні проходження світла через живу клітку фаза світлової хвилі міняється відповідно до коефіцієнта рефракції клітки: світло, яке проходить через відносно тонкі або відносно товсті ділянки клітки, затримується, і його фаза відповідно зрушується стосовно фази світла, яке проходить через відносно тонкі ділянки цитоплазми. Як у фазово-контрастному, так і в інтерференційному мікроскопі використовуються ефекти інтерференції, які виникають при рекомбінації двох наборів хвиль, що і створюють зображення клітинних структур. Обидва типи світлової мікроскопії широко використовуються для спостереження живих клітин.
Найпростіший спосіб розглянути деталі клітинної структури - спостерігати світло, яке розсіюється різними компонентами клітини. У темнопольному мікроскопі промені від освітлювача направляються збоку і при цьому в лінзи мікроскопа попадають тільки розсіяні промені. Відповідно клітина виглядає як освітлений об'єкт на темному полі. Одним з основних переваг фазово-контрастної, інтерференційної і темнопольной мікроскопії є можливість спостерігати рух клітин у процесі мітозу і міграції.
Високий контраст, який досягається за допомогою комп'ютерної інтерференційної мікроскопії, дозволяє спостерігати навіть дуже дрібні об'єкти.
За допомогою мікроманіпулятора було встановлено, що мітохондрії являють собою відносно стабільні утворення, які можна, неушкоджуючи, переміщати мікроголкою усередині клітини. Їх питома вага вище питомої ваги цитоплазми. Під час ультрацентрифугування живих клітин при 200000-400 000 g мітохондрії накопичуються у відцентрового полюса в неушкодженому виді.
Зміна об’єму і форми in vivo. Прижиттєві спостереження становлять особливий інтерес тоді, коли вони доповнюються цейтраферною мікрокінозйомкою. У культурі фібробластів можна спостерігати безперервні і часом ритмічні зміни об’єму, форми і розподілу мітохондрій. У русі мітохондрій розрізняють два основних типи: коливальні рухи і переміщення з однієї частини клітини в іншу, причому під час інтерфази вони значно більш активні, чим протягом мітозу. Іноді ці органоїди прикріплюються до оболонки ядра найближче до ядерця. Нитковидні мітохондрії можуть розпадатися на гранули, які здатні знову об’єднуватися в нитки. У деяких випадках рух мітохондрій зовсім пасивний й обумовлюється плином цитоплазми.