Существует целый ряд самых разнообразных солюбилизи-рующих агентов, пригодных для решения проблем мембранной биохимии. Наиболее надежными среди них являются неионные и ионные детергенты. В основе их действия лежит амфифиль-ная природа этих агентов, позволяющая им взаимодействовать и с гидрофильными, и с гидрофобными участками мембранных белков. Эффект детергента, разрушающего взаимосвязи в мембране, определяется двумя видами взаимодействия: детергент-белок и детергент—детергент. Большое значение имеет последнее взаимодействие, так как чем выше способность молекул детергента взаимодействовать друг с другом, тем меньше будет количество молекул, способных взаимодействовать с белками. Этот критерий мицеллообразования служит характеристикой детергента и его способности растворять те или иные белковые компоненты. Низкий коэффициент мицеллообразования характерен для мягких солюбилизирующих агентов, таких как тритон Х=Ю0, дезоксихолат натрия, дигитонин и другие, которые позволяют выделять нативные мембранные белки с сохранением их биологической активности. В то же время додецилсульфат натрия с высоким коэффициентом мицеллообразования обладает большой связывающей способностью и значительно повреждает нативную конформацию белков. Как правило, этот детергент используется при анализе субъединичной структуры макромолекул, так как легко разрушает межмолекулярные связи. Это свойство нередко применяется для определения молекулярной массы субъединиц белков при электрофорезе в присутствии ДСН.
Перед тем как приступить к дальнейшему выделению и изучению мембранных рецепторных белков, следует по возможности более полно удалить избыток детергента, поскольку он может оказывать нежелательное действие на биологическую активность и последующий физико-химический анализ структуры нейрорецептора.
Классические методы исследования мембранных белков, в том числе нейрорецепторов, включают практически все биохимические методы с учетом присутствия детергентов. Основным приемом специфического выделения ничтожно малых количеств нейрорецепторов является аффинная хроматография, которая позволила добиться впечатляющих успехов в изучении молекулярных свойств самых разнообразных типов нейрорецепторов.
Эффективность аффинной хроматографии зависит преимущественно от выбора лиганда или акцептора, который определяет природу выделяемого мембранного белка. Существенным фактором в этом случае является сродство лиганда к рецептору, и поэтому самыми эффективными лигандами оказываются специфические блокаторы или антагонисты нейрорецепторных белков. Иногда для выделения конкретного белка используют две или три ступени аффинной хроматографии на разных сорбентах и с разными лигандами. Получили широкое распространение методы иммуноаффинной хроматографии, в которых в качестве лиганда используется поликлональные или моноклональные антитела, полученные к компонентам рецептора.
Дальнейшее выделение и разделение фракций обычно осуществляют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, которая позволяет очищать индивидуальные компоненты мембранных белков. Причем обратнофазная хроматография дает уникальные возможности по разделению гидрофобных белков и пептидов. Нативность белковых компонентов рецепторов проверяют либо по лигандсвязьшающей функции, либо путем реконструкции их функции в разных модельных системах.
Одной из таких модельных систем, позволяющих контролировать ионтранспортные или ионселективные функции нейрорецепторов, служат липосомы. Способность липосом встраивать белки или целые рецепторные комплексы с сохранением их функциональной активности используется в мембранологии для моделирования функций белков "в чистом виде". В этом случае можно получать информацию о структурной организации компонентов, составляющих макромолекулу рецептора, и их внутренних перестройках в контролируемых условиях эксперимента.
В настоящее время разработано большое количество методов получения липосом, которые могут изменять фосфолипидный состав, заряд, "текучесть" или многослойность их компонентов. Размеры липосом могут варьировать от 25 нм до 100 мкм. Функцию белков, встраиваемых в липосомы, контролируют по динамике транспорта или накопления меченых ионов внутри липосом.
В последние годы исследователи возлагают особые надежды на иммунохимические способы идентификации структурных компонентов нейрорецепторов. Высокая специфичность антител и их способность узнавать разные антигенные детерминанты рецепторных комплексов широко используется для выяснения структурной организации нейрорецепторов и процессов их биосинтеза, включая генно-инженерные исследования. Иными словами, поли- и моноклональные антитела являются важным инструментом для изучения механизмов рецептии и общих вопросов нейробиологии.
Принципиальным решением множества проблем, связанных с применением антител, явилось создание новой гибридомной технологии, которая позволила получить моноклональные антитела. Эта техника была разработана в 1975 г. У.Келлером и А.Милстейном. Получаемые с помощью этого метода гибридные клетки синтезируют и выделяют в культуральную среду антитела, абсолютно одинаковые по своему сродству к той или иной антигенной детерминанте.
Гибридомная техника позволила получать самые разнообразные моноклональные антитела против химически индивидуальных антигенных детерминант на одной молекуле белка. В настоящее время моноклональные антитела широко используют для идентификации практически любых макромолекул, включая нейрорецепторы.
Следует подчеркнуть, что изучение структуры и функции нейрорецепторов и других мембранных компонентов нейрона является не самоцелью для нейробиологической науки. Важно понять, как молекулярные процессы, происходящие в нервных клетках, способны интегрировать самую разнообразную информацию и реализовать ее в виде сложных поведенческих, высших психических и эмоциональных реакций. Этот стратегический путь "от простого к сложному" получил в последние годы мощный импульс благодаря разработке принципиально новых способов прижизненной регистрации динамических биохимических реакций, происходящих в клетках головного мозга. Появились методы позитронно-эмиссионной томографии, ядерно-магнитного резонанса, гамма-сцинциграфии и другие, позволяющие прижизненно регистрировать системный метаболизм разных органов и тканей, включая головной мозг млекопитающих. Это создает предпосылки для успешного изучения нейрохимических основ формирования разнообразных функциональных состояний живого мозга человека, его наиболее сложной сферы деятельности —психической.
Одним из информативных методов является позитронно-эмиссионная томография, суть которой сводится к регистрации специальным устройством радионуклидных маркеров — меченых химических соединений, включающихся специфически в тот или иной метаболический процесс. Причем этот процесс может быть воспроизведен в виде томографических, т.е. объемных послойных изображений распределения позитронной метки по структурам и зонам головного мозга. Наиболее точная локализация достигается при использовании одновременно двух противостоящих детекторов, регистрирующих совпадающие лучи. В настоящее время уже существует хорошо разработанные приемы оценки функционального состояния головного мозга с помощью измерения локального метаболизма глюкозы, медиаторов, С02 и кислорода в процессе разнообразной деятельности индивида.
Важной особенностью метода, позволяющей его использовать в прижизненном исследовании деятельности мозга людей, является применение изотопов, излучения которых с учетом сроков распада безвредны для организма.
Сейчас получены четко различающиеся "карты" излучений при различных формах деятельности мозга человека, например восприятия слов, обдумывания слов, воспроизведения энграмм и др. Резкие различия регистрируются при воздействиях на мозг наркотиков и других психотропных агентов.
Естественно, что при дальнейшей разработке метода ПЭТ и его внедрении в клиническую нейробиологию возник вопрос о выборе адекватных маркеров, которые способны выявлять си-наптические реакции в нервной ткани. Ряд исследователей успешно работают с препаратами, которые позволяют визуализировать определенные нейрорецепторы и выявлять конкретные медиаторные пути, включающиеся в выполнение того или иного вида деятельности мозга человека. В клинике этот метод дает возможность проводить раннюю диагностику не только опухолевых новообразований, но и контролировать различные деструктивные процессы. Кроме того, применяя его, можно определять эффективность лечебного воздействия фармакологических средств и их правильный выбор для успешного лечения болезней мозга. В качестве иллюстрации к сказанному следует привести исследования, проводимые Вагнером и его коллегами по изучению вклада дофаминергических путей и их рецепторов в патогенез некоторых заболеваний. Выбор дофаминовых рецепторов был обусловлен их четкой локализацией в некоторых подкорковых экстрапирамидных структурах и известной их дисфункцией при двигательных расстройствах, паркинсонизме и шизофрении.
Предпосылкой для применения в ПЭТ агонистов и антагонистов дофаминовых рецепторов явились результаты радиоли-гандного связывания известных аналогов дофамина с синаптическими мембранами invitro. Параметры связывания, константы диссоциации и количество связывающих участков сопоставляли с данными, полученными при ПЭТ, так как связывание радиофармпрепаратов с мембранами клеток, головного мозга invivoимеет аналогичные закономерности. Расчет прижизненного взаимодействия нейрорецептор-лиганд имеет некоторые особенности, однако они учитываются непосредственно в программах компьютерного обеспечения. Наиболее удачными радио-лигандами для исследования дофаминовых рецепторов оказались антагонисты пС-метилспиперон и лУС-спироперидол. Поглощение и селективная избирательность накопления этих соединений в базальных ганглиях головного мозга коррелировали со степенью деструктивного процесса у больных паркинсонизмом. Эти исследования подтвердили гипотезу о первичной вовлеченности нигро-стриарных структур в регуляцию двигательных функций.