У 1503 році Флорентійська синьйорія дає Леонардо замовлення на прикрашення однієї зі стін зали Великої ради Палаццо Веккйо. На протилежній стіні мав виконати розпис Мікеланджело. Леонардо вибрав тему «Битва при Ангіарі», Мікеланджело – «Битва при Кашині». Ми знаємо про ці прославлені роботи великих флорентійців з рисунків авторів, розповідей сучасників та з копій. Мікеланджело виконав лише картон. Леонардо почав і живопис на стіні, однак його спіткала невдача. Майстер задумав працювати у техніці воскових фарб, використовуваних античними майстрами, - адже дух експерименту - це особливість творчості Леонардо. Проте ґрунт виявився нездатним увібрати важку фарбу, яка повільно висихала, і в процесі виконання розпису зображення почало обпливати, стікати донизу. Після невдачі Леонардо кинув роботу; виконання її синьйорія вимагала аж до 1507 року, поки, завдяки втручанню короля Франції, конфлікт було залагоджено. У Будапешті в музеї образотворчих мистецтв зберігаються рисунки воїнів для «Битви при Ангіарі». Обличчя випромінюють жорстоку енергію, максимальну концентрацію агресивних сил. Центральну частину розпису можна уявити з копії Рубенса, виконаної у 1603 році, - отже, ще на початку XVII століття картон існував. Обидві роботи, Леонардо і Мікеланджело, стали для сучасників та нащадків школою живописної майстерності, їх повсякчас копіювали. Більші за розмірами картони розрізали на шматки, і врешті-решт вони виявилися втраченими.
У процесі збирання матеріалу для «Битви при Ангіарі» Леонардо виконав численні анатомічні штудії, він першим ввів у практику живописців вивчення оголеної фігури, яке передувало зображенню її у драпуваннях. Від вивчення мотивів руху оголеної фігури він перейшов до розробки анатомії людського тіла як самостійної дисципліни. У другий флорентійський період майстер відвідував шпиталь Санта-Марія Нуова, робив розтин трупів, так було покладено початок Анатомічним зошитам, які нині зберігаються у Віндзорі .
Водночас Леонардо створив свій найпоетичніший твір - «Джоконду». Вазарі вражаюче повідав про те, як протягом чотирьох років Леонардо писав портрет флорентійки Мони Лізи, дружини купця Франческо ді Бартоломео дель Джокондо, і про те, що зображення здавалося правдивим і живим настільки, що «кожен, хто уважно вдивлявся в ямку на шиї, бачив у ній биття пульсу». Портрет заворожує глядачів уже протягом п’яти століть. Притягальна сила «Джоконди» пояснюється психологічною багатогранністю образу, котрий живе, дихає, змінює нюанси звучання. Найтонше сфумато моделює округлість обличчя, тіні оточують очі, погляд яких спрямований на нас, намічають усмішку, що зароджується і в той же час ніколи не зникає. Трепет життя присутній у всьому: у пасмах старанно виписаного волосся, прикритого вуаллю, у плавних складках одіжі, у виткому орнаменті коміра сукні, у руках, що спокійно лежать. Неоднозначний і пейзаж, вечірній, нібито освітлений примарним місячним сяйвом: петляє дорога, звивається стрічка ріки, зеленувато-блакитні води течуть повз гори, що здіймаються увись, немов химерні видива, вершини в міру заглиблення далечини стають блакитними. «Ти знаєш, що в такому повітрі найостанніші предмети, в ньому видимі, як, наприклад, гори, внаслідок великої кількості повітря, що міститься між твоїм оком та горою, здаються синіми, майже кольору повітря», писав Леонардо в манускрипті Ашбернхема. І світ людини, і світ природи складні, мінливі, фантастично прекрасні. Інтелект та почуття особистості, відображаючи закон всесвіту, перебувають у вічному русі. Глибоке розкриття внутрішнього світу людини вимагало від Леонардо удосконалення реалістичного методу, досліджень у галузі оптики, співвідношення форми і світла. Митець почав їх у перше десятиліття XVI століття, продовжив у Мілані, Римі, у Франції. Так поступово збагачувалися, ставали універсальними спостереження про науку живопису. Перші думки про трактат виникли у 1490-ті роки в Мілані. Відтоді обсяг рукописів постійно збільшувався, охоплюючи все нові й нові проблеми. Після смерті Леонардо да Вінчі його учень Франческо Мельці підготував «Трактат про живопис» до видання, однак твір тоді не вийшов друком. Його переписували, вивчали в скороченому вигляді у ХVI столітті, і лише у XVII було здійснено перші видання.
У 1507 році Леонардо переїздить до Мілана, що перебував тоді пі владою французів. Новий правитель Мілана, маршал Шарль Д'Амбуаз, схилявся перед талантом флорентійця. Визнаний геніальним, оточений численними учнями, Леонардо й далі веде наукову та художню творчість; ці дві форми діяльності, доповнюючи одна одну, вели до єдиної мети - пізнання всесвіту У 1510-1511 роках він зустрів Маркантоніо делла Торре, найвизначнішого анатома свого часу. Паоло Джовіо, який слухав лекції вченого в університеті Павії, писав: «Леонардо навчився з нелюдською старанністю робити нудотні розтини трупів, щоб правильно зображувати, суворо дотримуючись законів природи, різноманітні згини і натуги м'язів, з'єднаних нервами та суглобами. І тому він надзвичайно ретельно рисував на аркушах найдрібніші органи, аж до найтонших жилок і найприхованіших частин скелету, щоб ця багаторічна праця, розмножена в незчисленних гравюрах на міді, послужила мистецтву».
Пізнання анатомії не було для Леонардо холодною умоглядною наукою, - воно містило питання зачаття, народження і розвитку; водночас ті ж само проблеми він вивчав і в світі природи. Він рисував квіти, зав'язь, плоди. Поетичною реалізацією таких досліджень стала «Леда». В рисунку зі збірки музею Роттердама контрапост оголеної фігури створює спіралевидний, рухливий ефект, його підкреслює змієподібна шия лебедя, легкі лінії намічають на першому плані килим із в'юнистих квітів і трав, ліворуч тягнуться догори тугі трави, в їх тіні з'являються на світ діти-близнята. Світ постійно оновлюється. Стан ритмічного руху виникає завдяки закругленим лініям, складному порухові уклінної постаті. Ефект просторовості постаті, що стоїть на колінах, Леонардо використав у своїй першій, яка дійшла до нашого часу, живописній роботі - ангелі з картини Верроккйо, трохи пізніше - у «Святому Ієронімі», згодом - у «Мадонні у гроті». Уклінну Леду ми зорово обходимо навколо, як скульптуру, - художник збагачує просторові можливості живопису як виду мистецтва. Водночас Леонардо долає часові межі живопису, створюючи динамічне зображення - статику змінює розвиток. Волосся Леди у рисунку «Штудія голови Леди», як струмки, стихійно збігає у різні боки. Леонардо в будь-якому явищі прагнув знайти закономірності. У «Штудії постаті старого та потоків води» поряд з вируючими потоками він вміщує запис про те, які схожі рухи струменів води і пасом волосся. Ліву половину аркуша займає постать старого, заглибленого у роздум. У ній вбачають автопортрет Леонардо. Картина «Леда» користувалася популярністю у сучасників, про що свідчать численні копії, але доля оригінала Леонардо невідома.
У другий міланський період майстер створив останній живописний твір, що зберігся, - «Іоанн Хреститель». Його освітлення, оптичний ефект відповідають описові з «Трактату про живопис»: «Особливої чарівності тіні й світла надано обличчям, що зображені біля дверей темного житла; тоді око глядача бачить затемнену частину такого обличчя, потьмарену тінню цього житла, а освітлену частину того ж обличчя - з додаванням світлоти, наданої йому сяянням повітря; внаслідок такого посилення тіні та світла обличчя набуває більшої рельєфності, і в освітленій частині тінь майже не відчутна, а в затіненій частині світло майже непомітне. Через таку наявність і посилення тіні й світла обличчя стає особливо красивим». Чарівливість загадкової усмішки, матеріальна округлість тіла не відповідають традиційному образові пророка-аскета.
Дo початку другого десятиліття XVI століття головним художнім центром Італії стає Рим. У супроводі учнів Мельці та Салаї Леонардо в 1513 році вирушає у «вічне місто». Молодший брат папи Лева Х, Джуліано Медічі, надав художникові для наукових досліджень апартаменти у Ватіканському Бельведері. До цього часу належать записи й рисунки з анатомії птаха, спостереження за його ширянням. Можливість подолати земне притягання, піднятися у повітря - фантастична мрія для епохи Відродження. Леонардо вперше насмілився створити літальну машину в Мілані, потім настала перерва, однак ідея польоту не полишала його, таємниця ширяння знову приковує його увагу. Зі всіх створінь тваринного світу, як повідомляв Вазарі, Леонардо понад усе любив птахів (яким повертав втрачену волю, купуючи їх у торговців і тут же випускаючи з кліток) та коней (яких він звичайно тримав, хоча й не був багатим). Грація і сила коня - мотив, що постійно повторюється в його рисунках протягом усього життя. «Штудії коней, святого Георгія та дракона» створені вже у Франції.
Наприкінці 1516 року на запрошення Франціска І Леонардо їде у Францію, оселяється у замку Клу, поблизу Амбуаза. Тут 2 травня 1519 року великий художник помер
В останні роки життя Леонардо вів систематизацію численних наукових досліджень. Нелегко назвати галузь знання, яка б не привернула його уваги: це гідравліка і механіка, ботаніка і зоологія, геологія, метеорологія й астрономія, оптика й акустика, математика і геометрія. Записи Леонардо успадкував його улюблений учень Франческо Мельці. Численні рукописи та рисунки, які нині розрізнені і зберігаються в різних музеях світу, свідчать про енциклопедичну багатогранність генія Леонардо. Для митця з Вінчі набуття знань означало не пасивне їх зберігання, а активне використання для проникнення в потаємну суть світобудови. Універсальною наукою пізнання сутності буття, на думку майстра, був живопис.