Таблиця 2
Глікозилювання п-трет-бутилфенолу і п-тіокрезолу хлоридом 1
| Умови реакції | Тривалість реакції, г* | Глікозид; вихід %** | ||
| Каталізатор | Основа | Розчинник | ||
| BnEt3NCl | NaOH | Н2О / CHCl3 | 16 | 3r; 34,5±1,4 |
| Bu4NBr | NaOH | Н2О / CHCl3 | 1 | 3r; 37,1±2,4 |
| 15-краун-5 | К2СО3 | MeCN | 4 | 3r; 42,5±8,0 |
| BnEt3NCl | NaOH | Н2О / CHCl3 | 1 | 17p; 65,1±6,8 |
| 15-краун-5 | К2СО3 | MeCN | 4 | 17p; 50,9±3,7 |
| - | Et3N | MeCN | 5 | 17p; 49,4±6,3 |
* До зникнення за даними ТШХ глікозил-донору 1.
** Середнє значення з трьох експериментів.
Сигнали аномерного протона тіоглікозидів (d 4,78-4,82 м.ч.) зміщені в сильне поле в порівнянні з відповідними сигналами О-в-глікозидів (d 5,20-5,24 м.ч.). КССВ складає 10-10,5 Гц, що характерно для S-1,2-транс-D-глюкозамінідів і суттєво відрізняється від J1,2 8 Гц у О-в-арилглікозидів.
Подальший синтез глікопептидів проводився звичайним шляхом відповідно до схеми, представленої на рис. 1. Структура глікопептидів 8p-s, 22p,r і 23p,r підтверджена 1Н ЯМР спектроскопією.
Вивчення антивірусної дії в-алкілглікозидів MDP
Моделі інфекцій людини на лабораторних тваринах, зокрема грипу, широко використовуються для вивчення антиінфекційної дії та імунотоксичних характеристик різних речовин. На кафедрі мікробіології Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгіївського (завідувач проф. Криворутченко Ю.Л.) було досліджено вплив на експериментальну грипозну інфекцію мишей чотирьох похідних MDP 9а-d (рис. 8).
в-Децил-MDP 9а в профілактичній схемі в дозі 2 мкг/мишу сприяв виживанню тварин, надаючи помірний протективний ефект. У дозі 20 мкг/мишу речовина прискорювала загибель тварин, але до кінця експерименту різниця в числі тварин, що вижили, в контрольній і експериментальній групі зникала. Введення речовини за терапевтичною схемою демонструвало помірний протективний ефект.
в-Додецил-MDP 9b при обох формах введення і концентраціях має імунотоксичний ефект. Профілактичне введення в-тетрадецил-MDP 9с приводило до імунотоксичної дії в обох концентраціях, а для в-гексадецил-MDP 9d порівнянна імунотоксична дія спостерігалася в концентрації 2 мкг/мишу. У вищій дозі глікозид 9d практично не впливав на летальність заражених тварин, що, напевно, було пов'язано з його практичною нерозчинністю у вказаній концентрації. Таким чином з цієї групи глікопептидів захисний ефект спостерігався тільки для в-децил-MDP 9а.
Вивчення антибактеріальної протективної дії глікозидів MDP
У Інституті морфології людини РАМН (м. Москва) під керівництвом проф. О.В. Калюжина було вивчено дія ліпофільних мурамоїлдипептидів на імунну систему в тесті стимуляції антибактеріальної резистентності у мишей при внутрішньочеревинному введенні свідомо летальної дози бактерійного збудника. Перший експеримент включав вивчення протективної дії 15 глікозидів MDP (9а-е,k-s, 16b,l) при зараженні мишей Staphylococcus aureus (рис. 9).
Всі досліджені глікозиди мурамоїлдипептиду мають захисну дію на мишей при внутрішньочеревинному введенні препаратів. Так п'ять в-алкілглікозидів MDP 9а-е в досліджуваних дозах знижували летальність практично до нуля у всіх експериментах.
Найбільша захисна дія для мурамоїлдипептидів з агліконами аліциклічної і арилаліфатичної природи спостерігалася для в-циклододецил-MDP 9l. Слід зазначити опозитний вплив доз двох ізомерних арилетилглікозидів MDP на стимуляцію антиінфекційної резистентності - для в-2-п-біфенілетил-MDP 9о активність із зменшенням кількості імуномодулятора зменшувалася, а для в-2,2-дифенілетил-MDP 9n навпаки різко зростала. в-2-(Адамантил-1)етил-MDP 9m показав помірний протективний ефект, а найменшу з цієї групи сполук імуностимулюючу активність проявив в-4-трет-бутилциклогексил-MDP 9k.
Не виявлено достовірної відмінності в імуностимулюючій дії a- і b-додецил-MDP 16b, 9b та a- і b-циклододецил-MDP 16l, 9l. Мабуть, вплив ліпофільності аглікону на протективну дію перевершує над впливом конфігурації його глікозидного центру.
Із О-в-п-алкілфенілглікозидів MDP найбільший протективний ефект показали в-п-толіл-MDP 9p і в-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)феніл-MDP 9s. До того ж глікозид 9s був активніше відповідних арилалкільних глікозидів мурамоїлдипептиду - в-2-п-біфенілетил-MDP 9о і в-2,2-дифенілетил-MDP 9n, що також містять 14 атомів Карбону в агліконі. Захисний ефект навіть найменш активного в цій групі сполук - в-4-трет-бутилфеніл-MDP 9r був більший, ніж у відповідного аліциклічного аналога - в-4-трет-бутилциклогексил-MDP 9k.
З огляду на те, що дослідження захисної дії першої групи глікопептидів для значної частини похідних не виявило відмінностей в діапазоні доз 2-200 мкг/мишу, другий експеримент проводили з меншими дозами і двадцятикратним кроком розбавлення (рис. 10). Дані експерименту свідчать про те, що з групи в-діалкілметилглікозидів MDP 9f-i найбільша стимуляція резистентності спостерігалася для в-(нонадецил-10)- і в-(трикозаніл-12)глікозидів MDP 9h,i в дозі 2 мкг/мишу. Для в-(ундецил-6)-MDP 9f навпаки в цій дозі стимулююча активність не виявлялася.
З метою виявлення впливу природи глікозиду спільно з S-глікозидами MDP 23p,r вивчалися відповідні О-арилглікозиди 9p,r. У разі менш ліпофільних О- і S-в-п-толілглікозидів MDP 9p і 23p не виявлено відмінностей в біологічній дії. Тоді як більш ліпофільний в-п-трет-бутилфенілтіо-MDP 23r (СlogP 4,36 у п-трет-бутилтіофенолу у порівнянні з СlogP 3,30 у п-трет-бутилфенолу) був декілька активніше свого О-аналога 9r.
Третій експеримент проводили в умовах сепсису, викликаного грамнегативними бактеріями Escherichia coli. Як і в другій серії експериментів, для того, щоб виявити відмінності в імунотропній активності досліджуваних глікозидів MDP, були використані нижчі дози препаратів в ширшому діапазоні (рис. 11).
Це тестування багато в чому контрастувало з результатами першого експерименту. Наприклад, один з найбільш активних препаратів у разі використання S. aureus в-циклододецил-MDP 9l при ураженні мишей грамнегативною інфекцією в досліджуваному діапазоні доз не мав захисної дії. Не виявлено чіткого впливу ліпофільності агліконів на протективну антиінфекційну дію для більшості сполук з вивченої групи глікозидів мурамоїлдипептиду. Можливо, це пов'язано з тим, що в умовах моделі in vivo тестовані речовини в різних дозах починають діяти в синергізмі/антагонізмі з різними бактерійними продуктами і компонентами, наприклад, ліпополісахаридом.
Суттєве зниження летальності було виявлено тільки для в-тетрадецил-MDP 9с, в-4-трет-бутилфеніл-MDP 9r і в-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)-феніл-MDP 9s (доза 1 мкг/мишу), а також для в-децил-MDP 9а і в-(ундецил-6)-MDP 9f (доза 20 мкг/мишу).
Результати, що отримані для аномерних пар a- і в-додецил- (16b, 9b), a- і в-(ундецил-6)- (16f, 9f) та a- і в-циклододецил- (16l, 9l) MDP, як і у разі дослідження глікозидів MDP при ураженні мишей грампозитивною бактерією, не дозволило виявити чіткого впливу ні конфігурації глікозидного центру, ні введення ліпофільних агліконів на протективну антиінфекційну дію глікозидів MDP.
Нами була зроблена спроба оцінити вплив ліпофільності аглікону глікопептидів на виживаність тварин при ураженні S. aureus у разі найменшої з досліджених доз препарату, для якої найменше вірогідні дозозалежні ефекти (рис. 12, 13).
Для більшості вивчених речовин спостерігається тенденція до зростання протективної дії із збільшенням ліпофільності агліконів. З цього ряду випадають в-децил- (9а) і в-2,2-дифенілетил- (9о) мурамоїлдипептиди, для яких в даній дозі спостерігається максимальний ефект.
Аналогічно оцінювалося і вплив ліпофільності агліконів на виживання тварин при дії глікозидів MDP 9f-i,p,r, 23p,r, які тестувалися другою групою (рис. 13). Чітка кореляція спостерігається тільки для в-діалкілметилглікозидів MDP 9f-i.
На основі результатів тестування протективної активності ліпофільних глікопептидів найбільш перспективними сполуками для проведення розширених біологічних випробувань є в-децил-, в-тетрадецил- і в-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)феніл-MDP.
висновки
В рамках дисертаційної роботи застосування напівемпіричних підходів до дизайну глікозидів мурамоїлдипептиду дозволило отримати нові типи модифікацій: б- і в-діалкілметил-, в-п-алкілфеніл- і в-арилтіоглікозидів MDP, а також розширити ряди похідних MDP по аномерному центру новими ліпофільними глікозидами на основі лінійних аліфатичних і аліциклічних спиртів, 2-(адамантил-1)- і арилетанолів. Дослідження стимуляції глікозидами MDP антиінфекційної резистентності у мишей дозволило виявити вплив структури аглікону глікопептидів на їх біологічну активність.
1. Показано, що з вивчених прямих методів синтезу N-ацетил-D-глюкозамінідів оксазоліновий метод є найбільш ефективним для препаративного отримання в-алкілглікозидів, а глікозилювання перацетатом б-D-глюкопиранозилхлориду в умовах міжфазного каталізу у присутності бензилтриетиламонійхлориду – для в-п-алкіларилтіоглікозидів.
2. На підставі даних спектроскопії 2D1H ЯМР вперше встановлено, що при глікозилюванні цис-,транс-4-трет-бутилциклогексанолу оксазоліновим методом переважно утворюється транс-4-трет-бутилциклогексил-в-D-глюкозамінід.
3. Вперше показано, що збільшення ліпофільності аглікону глікозидів MDP приводить до отримання похідних MDP, що проявляють більш високі імуностимулюючі властивості. Знайдені лідери у ряду похідних MDP: в-децил-, в-додецил-, в-тетрадецил-, в-гексадецил-, в-октадецил-, в-(трикозаніл-12) -, в-циклододецил-, в-п-толіл- і в-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)феніл-MDP, що індукують високий протективний ефект до внутрішньочеревинного зараження мишей S. aureus, а також в-тетрадецил-, в-4-трет-бутилфеніл- і в-п-(1,1,3,3-тетраметилбутил)феніл-MDP, що стимулюють резистентність мишей до зараження Е. coli.