В работе использовались следующие материалы и реактивы:
трис, агароза - “ICN” (США);
хлорид магния, ацетат натрия - “Merck” (Германия);
персульфат аммония, SDS, акриламид, реактив Брэдфорда QuickStartBradfordDyeReagent, набор стандартных концентраций бычьего сывороточного альбумина QuickStartBovineSerumAlbuminStandardSet, маркер “Калейдоскоп” - “BioRad" (США);
набор ECL Western Blotting Analysis System - “Amersham Biosciences" (Великобритания);
ингибиторный коктейль Protease Inhibitor Coctail Tablets - “Roche Diagnostics" (Германия);
ЭДТА, бромфеноловый синий, кумасси G250, рибонуклеаза А (РНКаза А),
N,N’-метиленбисакриламид - “Serva” (Германия);
набор реактивов Рентген-2: проявитель рентгеновских материалов типа РМ-1 и РФ-3, фиксаж нейтральный - химзавод им.Л.Я. Карпова (Менделеевск, Татарстан);
глицин, твин-20, PBSTablets - “Helicon” (Россия, Москва);
N-лаурилсаркозин (натриевая соль), IGEPALCA-630 - “SIGMA” (США);
алциановый голубой - “Loba-Chemie” (Австрия);
альбумин лиофилизированный из человеческой сыворотки, TEMED - “ Reanal” (Венгрия);
буфер для нанесения проб NuPageSDSSampleBuffer (x4) - “Invitrogen" (CША).
Специфические ферменты деградации ГАГ:
хондроитиназа АС (хондроитин АС лиаза), ЕС 4.2.2.5, из Flavobacteriumheparinum,
хондроитиназа АВС (хондроитин АВС лиаза), ЕС 4.2.2.4, из Proteusvulgaris - “SIGMA” (США).
Стандарты ГАГ:
гепарин - “Richter” (Венгрия);
хондроитинсульфат А (натриевая соль) из хряща кита,
хондроитинсульфат В (натриевая соль) из кожи свиньи,
хондроитинсульфат С (натриевая соль) из хряща акулы - “SIGMA” (США).
Антитела:
D-глюкуронил С5-эпимераза человека: кроличья поликлональная сыворотка - “GenScriptCorp” (США);
коровый белок декорина человека: мышиные моноклональные антитела IgG1 - “R&DSystems”;
вторичные антитела, меченые пероксидазой хрена - “AmershamBiosciences" (Великобритания).
Этиловый спирт, ацетат калия, ацетат бария, нитрит натрия, фенол, хлороформ, хлорид натрия, уксусная, серная, соляная, хлорная, фосфорная кислоты, глицерин, бутанол-1, диметилсульфоксид - отечественного производства категории ХЧ или ОСЧ.
диализные трубки Servapor, диаметр 7 мм - “Serva” (Германия);
рентгеновская плнека CL-XPosureFilm - “Perbio”;
ацетатная пленка (ацетатцеллюлоза) - отечественного производства;
нитроцеллюлозная мембрана - “Schleicher&Schuell" (Германия).
Приборы:
источник питания постоянного тока Б5-50;
спектрофотометры SPEKOL21 и EppendorfBioPhotometer;
центрифуги EppendorfCentrifuge5414 и 5415С;
качающаяся платформа MiniRockerMR-1, центрифуга Фуга/Вортекс микро-спин FV-2400 - “BioSan" (Латвия);
электроприбор контактный сварочный бытовой “Молния-3”;
микротермостат модель 205 (Кольцово);
трансблоттер Semi-driTransferUnit, TE70 - “AmershamBiosciences" (США).
В работе использовали опухолевую и окружающую нормальную ткань молочной железы человека, удаленную в ходе хирургического вмешательства. Операционный материал получали в 1 Городской клинической больнице, забор образцов проводили под контролем главного онколога г. Новосибирска д. м. н., проф. Сидорова С. В.
Экспериментальный материал состоял из 2 образцов: опухолевая ткань и нормальная ткань молочной железы человека.
В работе использовали фирменные антитела:
к D-глюкуронил С5-эпимеразе человека - поликлональная кроличья сыворотка (антигенная последовательность pos602-615: VKRWKSYLKGSRAKC - С-конец белка);
к коровому белку декорина человека - моноклональные мышиные антитела класса IgG1, клон 115402 (500 мкг/мл).
Протеогликаны выделяли методом, разработанным в лаборатории структуры генома к. б. н. Рыковой В.И.
Замороженный кусочек ткани (100 - 1000 мг) растирали в жидком азоте. Затем добавляли буфер (10 мMТрис-HCl, 5 мMЭДТА, pH8), из расчета 1 мл буфера на 100 мг ткани. Буфер приливали порциями по 1-2 мл прямо в жидкий азот. Ледяной порошок тщательно растирали. Полученный гомогенат переносили в стеклянную пробирку. К гомогенату ткани добавляли 35% N-лаурилсаркозин, из расчета 10 мкл 35% N-лаурилсаркозина на 100 мг ткани. Инкубировали 1 час при комнатной температуре для растворения клеточных мембран. Гомогенат разносили по 1 мл в пробирки Eppendorf (1.5 мл) и добавляли по 0.5 мл фенола (насыщенного водой) в каждую пробирку, тщательно встряхивали. Центрифугировали 10 мин. при 10 тыс. об. /мин. Получалось 3 фракции: верхняя - водная (нуклеиновые кислоты, ПГ и нейтральные сахара), средняя (интерфаза) - плотный слой белка, нижняя - фенольная. Отбирали верхнюю водную фракцию и переносили ее в чистые пробирки. Повторяли депротеинизацию: добавляли к водной фракции по 0.25 мл фенола и хлороформа. Центрифугировали 10 мин. при 10 тыс. об. /мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, добавляли к ней концентрированную хлорную кислоту до 0.5 М конечной концентрации кислоты (для осаждения нуклеиновых кислот). Инкубировали на холоду 20 мин. (погружали пробирки в лед). Осадок отделяли центрифугированием (5 мин. при 10 тыс. об. /мин.). Кислый супернатант отделяли от осадка (в супернатанте - ПГ). Избавлялись от хлорной кислоты диализом: сначала против воды (2 ч.), затем против 50 мMацетата натрия (40 мин.). Концентрировали раствор ПГ бутанолом-1 до объема 50-100 мкл: приливали максимально возможное количество бутанола в пробирку, встряхивали, центрифугировали (1 мин. при 10 тыс. об. /мин.). Бутанол отнимает 10% воды (от своего объема). Сливали бутанол. Повторяли процедуру несколько раз - до тех пор, пока не получали требуемый объем раствора. В сконцентрированный раствор добавляли 2-3 объема 96% этилового спирта (перегнанного) для осаждения ПГ. Пробирки тщательно встряхивали и оставляли на ночь в морозильной камере (-20оС). Центрифугировали (10 мин. при 10 тыс. об. /мин.). Сливали спирт, осадок еще раз промывали этанолом (200-400 мкл). Центрифугировали 5 мин. при 10 тыс. об. /мин. Спирт сливали, осадок высушивали на воздухе.
Осадок растворяли в 20-40 мкл буфера (10 мMТрис-HCl, 5 мMЭДТА, pH8) или воды. Это готовый рабочий раствор ПГ.
2.2.2.1 Обработка препаратов протеогликанов щелочью
Пробы ПГ (из контрольной и опухолевой ткани) инкубировали с 0.5 Nгидроксидом натрия в соотношении 1: 1 при 37оС в течение 1 ч. По окончании реакции пробы нейтрализовали 0.5 Nуксусной кислотой.
2.2.2.2 Обработка препаратов протеогликанов нуклеазами
К 10 мкл раствора ПГ добавляли 1 мкл ДНКазы (1 е. а. /мкл), 2 мкл 10х буфера для ДНКазы и 2 мкл РНКазы (0.6 е. а. /мкл). Инкубировали при 37оС в течение 3 ч.
2.2.3.1 Обработка препаратов протеогликанов специфическими ферментами
Пробы ПГ обрабатывали хондроитиназой АС (0.1 е. а. /мкл) и хондроитиназой АВС (0.1 е. а. /мкл), гидролизующими соответственно хондроитинсульфаты А и С и хондроитинсульфаты А, С и В (дерматансульфаты). Ферменты добавляли к пробам в соотношении 1:
1. Инкубацию проводили в течение 17-20 ч. при 37оС. Результаты обработки ферментами анализировали с помощью гель - электрофореза (см. п.2.2.6.1.). В качестве контроля использовали необработанные пробы ПГ.
2.2.3.2 Обработка препаратов протеогликанов азотистой кислотой
Азотистая кислота избирательно расщепляет углеводные цепи гепарансульфата, не затрагивая гликозаминогликаны других типов, что позволяет обнаружить его присутствие в препарате.
Азотистую кислоту получали в реакционной смеси:
5% NaNO2 + 33% СH3СООН = HNO2
Пробы ПГ инкубировали с 5% нитритом натрия и 33% уксусной кислотой в соотношении 1: 1: 1 при комнатной температуре в течение 40 мин., затем результаты анализировали с помощью гель - электрофореза (см. п.2.2.6.1.). Контролем служили соответствующие необработанные пробы ПГ и гепарин (10 мкг/мкл), обработанный азотистой кислотой (1: 2: 2).
2.2.4.1 Количественный анализ гликозаминогликанов с алциановым голубым
Содержание ГАГ в препаратах определяли на полосках ацетатцеллюлозной пленки (L. J. Hronowski, T. P. Anastassiades // Anal. Bioch. 1988.174. № 2, 501-511).
Пленку предварительно вымачивали в буфере 0.1М ацетат бария, рН 3, удаляли излишки буфера с помощью фильтровальной бумаги и подсушивали на воздухе. На подготовленную пленку наносили пробы (по 2 мкл) и опускали на 30 мин. в краситель - 0.2% алциановый голубой (АlBl8GS), 30 мМ хлорид магния, 0.1% уксусная кислота, 10% этанол, рН 3. После окрашивания полоски промывали аналогичным раствором, не содержащим АlBl8GS, переносили на фильтровальную бумагу и высушивали на воздухе. Окрашенные пятна гликозаминогликанов и неокрашенные участки пленки такого же размера (для контроля) вырезали и помещали в пробирки. В каждую пробирку добавляли по 2 мл диметилсульфоксида, содержащего 0.5% (V/V) концентрированную серную кислоту и инкубировали в течение 30 мин. при 37оС. Затем измеряли оптическое поглощение растворов при 677 нм против раствора диметилсульфоксида, содержащего 0.5% серную кислоту. Вычитали показания контроля.
Содержание гликозаминогликанов определяли по калибровочной кривой, построенной при измерении Д677 растворов ГАГ известной концентрации.
Измерения проводили на спектрофотометре SPECOL21.
2.2.4.2 Определение концентрации белка по Брэдфорду
Определяли концентрацию суммарного белка в гомогенате ткани по Брэдфорду
(Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985, стр.342).
Готовили краситель: 10 мг кумасси ярко синего G250 растворяли при энергичном перемешивании в 5 мл 95% этилового спирта и смешивали этот раствор с 10 мл 85% фосфорной кислоты. Смесь разбавляли водой до 100 мл и фильтровали для удаления нерастворившегося красителя (раствор устойчив 1-2 недели).
На реакцию брали пробу и краситель в соотношении 1: 1, инкубировали 20 мин. при комнатной температуре. Затем измеряли оптическое поглощение растворов при 595 нм против раствора краситель + вода (1:
1). Содержание белка определяли по калибровочной кривой, построенной при измерении Д595 растворов альбумина известной концентрации.