Нарушение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможная причина изменения структуры протеогликанов в опухоли молочной железы человека (стр. 9 из 12)

3.3.2 Обработка препаратов протеогликанов нуклеазами

Очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот с помощью ДНКазы и РНКазы имеет значительное преимущество перед щелочным гидролизом проб, так как при этом не затрагивается структура протеогликанов.

Препараты протеогликанов, выделенных из нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека, обрабатывали нуклеазами (см. п.2.2.2.2.). Результаты обработки анализировали с помощью гель-электрофореза (рис.12).

А.

1 - стандартная смесь ГАГ, 2 - контрольная ткань, 3 - опухолевая ткань

В.

1 - стандартная смесь ГАГ, 2 - контрольная ткань, 3 - опухолевая ткань,

4 - РНК из печени крысы

Рис.12. Препараты протеогликанов до (А) и после (В) обработки нуклеазами

Из приведенных на рис.12 электрофореграмм видно, что после обработки проб ПГ нуклеазами, удаляется значительная примесь нуклеиновых кислот, присутствовавшая в неочищенных препаратах.

Таким образом, нами подобран метод очистки ПГ от примесей нуклеиновых кислот, состоящий в обработке препаратов ПГ нуклеазами.

3.4 Сравнение состава протеогликанов в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека

Протеогликаны, выделенные из контрольной и опухолевой ткани молочной железы, разделяли методом электрофореза и сравнивали по электрофоретической подвижности со стандартами ГАГ (рис.13).

Рис.13. Протеогликаны контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека

1 - стандартная смесь ГАГ

2 - пациент № 53, контрольная ткань

3 - пациент № 58, контрольная ткань

4 - пациент № 58, опухолевая ткань

5 - пациент № 59, контрольная ткань

6 - пациент № 59, опухолевая ткань

Как видно из рисунка 13, в опухолевой ткани происходит увеличение содержания суммарных протеогликанов, а также появляется значительная фракция ПГ, соответствующая по электрофоретической подвижности хондроитинсульфатам А и С, отсутствующим в контрольной ткани.

В опухолевой ткани пациентов, прошедших предоперационное лечение, такой тенденции не наблюдалось (рис.14). Возможно, в результате лечения содержание ПГ в опухолевой ткани меняется и становится более близким к норме. Однако данный факт требует дополнительного изучения.

Рис.14. Протеогликаны из ткани пациента, прошедшего предоперационное лечение

Пациент № 67

1 - контрольная ткань

2 - опухолевая ткань

3 - стандартная смесь ГАГ

Таким образом, можно сделать вывод, что в опухолевой ткани происходит увеличение содержания суммарных протеогликанов, и появляется значительная фракция ПГ, соответствующая по электрофоретической подвижности хондроитинсульфатам А и С, отсутствующим в контрольной ткани. У пациентов, прошедших предоперационное лечение, такой тенденции не наблюдается.

Чтобы подтвердить факт увеличения содержания суммарных протеогликанов в опухолевой ткани молочной железы человека по сравнению с контрольной тканью, необходимо провести количественную оценку ПГ.

3.5 Количественная оценка протеогликанов

Количественный анализ ГАГ в пробах проводили по методу 2.2.4.1 Каждое измерение выполняли в трех повторах, полученные результаты усредняли. Нормировали количество гликозаминогликанов на грамм взятой на исследование ткани (таблица 11).

Таблица 11. Оценка содержания гликозаминогликанов в клинических образцах в пересчете на массу ткани

Пациент	Суммарное количество ГАГ в ткани, мкг		Масса ткани, г	ГАГ, мкг/г ткани	ГАГопухоль/ ГАГконтроль
63	контроль	1.5	0.34	4.5	2.1
	опухоль	4.5	0.48	9.3
64	контроль	1.2	0.46	2.6	4.9
	опухоль	3.6	0.29	12.6
70	контроль	5.6	0.46	12	6
	опухоль	74	1.03	72
72	контроль	4	0.7	5.5	4.2
	опухоль	34	1.47	23
96	контроль	0.5	0.34	1.6	9.3
	опухоль	4.7	0.32	14.5
112	контроль	1.6	0.51	3.2	1.2
	опухоль	1.4	0.4	3.6
115	контроль	1.6	0.54	2.9	5
	опухоль	4.2	0.29	14.4
116	контроль	3.8	0.66	5.8	1.4
	опухоль	2.3	0.3	7.8

Таким образом, в опухолевой ткани молочной железы человека происходит увеличение содержания ГАГ по сравнению с контрольной тканью.

Однако пересчет количества ГАГ на массу ткани в данном случае может оказаться не точным из-за разного содержания жира в контрольной и опухолевой ткани. Поэтому мы также нормировали количество ГАГ на другой параметр: на содержание нуклеиновых кислот или белка в пробе.

Концентрацию нуклеиновых кислот в пробах определяли по методике 2.2.4.3.

Параллельно определяли содержание ГАГ в тех же образцах (таблица 12).

Таблица 12. Оценка содержания гликозаминогликанов в клинических образцах в пересчете на количество суммарных нуклеиновых кислот

Пациент	Суммарное количество ГАГ в ткани, мкг		Суммарное количество НК в ткани, мкг	ГАГ/НК	ГАГопухоль/ГАГконтроль
63	Контроль	1.5	151	1.01x10-2	1.7
	Опухоль	4.5	257	1.74 x10-2
64	Контроль	1.2	138	8.5 x10-3	0.6
	Опухоль	3.6	680	5.4x10-3
96	Контроль	0.5	582	9х10-4	5.6
	Опухоль	4.7	892	5х10-3
112	Контроль	1.6	337	4.7 x10-3	1.1
	Опухоль	1.4	271	5.3 x10-3
115	Контроль	1.6	156	10-2	0.8
	Опухоль	4.2	509	8.2 x10-3
116	Контроль	3.8	151	2.5 x10-2	2.4
	Опухоль	2.3	38	6.2 x10-2

Из данных, приведенных в таблице 12, видно, что при пересчете количества ГАГ в пробе на количество суммарных нуклеиновых кислот в ней также происходит увеличение содержания ГАГ в опухолевой ткани по сравнению с контрольной. Однако это увеличение не столь значительное, как при нормировании содержания ГАГ в пробах на массу ткани. Возможно, причина этого состоит в том, что в опухолевой ткани происходит увеличение содержания нуклеиновых кислот. Поэтому мы дополнительно нормировали количество ГАГ в ткани на количество белка в ней (таблица 13).

Концентрацию белка в ткани определяли по Брэдфорду (см. п.2.2.4.2.)

Таблица 13. Оценка содержания гликозаминогликанов в клинических образцах в пересчете на количество суммарного белка

Пациент	Масса ткани, взятой на выделение ГАГ, г		Масса ткани, взятой на выделение белка, г	ГАГ, мкг/г ткани	Белок, мкг/г ткани, x104	ГАГ/Белок, x10-4	ГАГопухоль/ГАГконтроль
63	Контроль	0,34	0,55	4,6	1.0	4.6	0.4
	Опухоль	0,48	0,12	9,3	6.0	1.6
112	Контроль	0,51	0,11	3,2	1.7	1.8	0.7
	Опухоль	0,4	0,06	3,6	2.8	1.3
115	Контроль	0,54	0,1	2,9	2.4	1.2	4.1
	Опухоль	0,29	0,12	14,4	2.9	4.9
116	Контроль	0,66	0,07	5,8	1.6	3.7	1.3
	Опухоль	0,3	0,04	7,8	1.6	4.8

Согласно полученным данным, у пациентов 63 и 112 происходит снижение содержания ГАГ в опухолевой ткани молочной железы по сравнению с контрольной тканью. В то же время у пациенов 115 и 116 содержание ГАГ в опухолевой ткани повышено (в 4.1 и 1.3 раза, соответственно). Возможно, такие различия связаны с индивидуальными особенностями пациентов, их клиническими диагнозами. Данный факт требует дальнейшего изучения.

Таким образом, полученные нами данные подтверждают факт увеличения содержания ГАГ (и протеогликанов) в опухолевой ткани молочной железы человека по сравнению с контрольной тканью (в пересчете на массу ткани - в среднем в 4.3 раза, в пересчете на количество суммарных нуклеиновых кислот в пробе - в среднем в 2 раза).

Для того чтобы определить, за счет каких именно классов протеогликанов происходит данное увеличение, нами была проведена идентификация фракций протеогликанов, выделенных из нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.

3.6 Идентификация фракций протеогликанов

Идентификацию фракций протеогликанов проводили с помощью специфических ферментов деградации ГАГ, а также с помощью азотистой кислоты.

3.6.1 Обработка препаратов протеогликанов специфическими ферментами

Пробы ПГ обрабатывали специфическими ферментами деградации ГАГ (см. п.2.2.3.1.): хондроитиназой АС, которая гидролизует хондроитинсульфаты А и С, и хондроитиназой АВС, гидролизующей хондроитинсульфаты А, В (ДС) и С (рис.15).

Рис.15. Препараты протеогликанов до и после обработки специфическими ферментами