3. Химический состав.
Состав: Так как прополис не является определенным веществом, у него не может быть химической формулы. Как доказал автор этих строк в сообщении, представленном профессором БУВЬЕ 26 ноября 1923 года в Парижской академии наук, прополис не бальзам а смола, состоящая из множества различных веществ, которые могут быть выделены методом растворителей. Самая интересная из существующих по этому вопросу работ — «Исследование канадского прополиса» — опубликованная в канадском журнале «Канэдиен Кемистри» химиком М. Т. П. ГЛЕДСТОН ШОУ. (5.).
Плотная или липкая упруго-вязкая масса зеленовато-бурого или темно-
коричневого цвета с сероватым оттенком, специфическим запахом, горьковато-жгучая на вкус. Почти нерастворим в воде, растворим в спирте.
Растворяется в горячем метиловом спирее, 70 % - этиловом спирте и нашатырном спирте, петролейном эфире, уксусной кислоте. Растворимость в воде низкая. При хранении образует твердую массу темно – коричневого цвета. В состав входят смолистые вещества – 50 – 55%, воск около 30 %, эфирные и бальзамические масла – 8 -10%, а также небольшое количество примесей и пыльца. Хранят в виде кусочков по 150 -200 г завернутых в пергаментную бумагу, закрытой посуде темного цвета. (7,8,9).
Химический анализ показывает наличие в прополисе ряда природных соединений (флавонов, флаванонов, флаванолов, производных коричной кислоты, ацетоксибетулинола и др.), содержащихся в почках деревьев (березы, тополя и др.), с которых пчелы собирают клейкие выделения. (8).
3.1 СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА
И БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОПОЛИСА
И ЕГО ИСТОЧНИКОВ
Разносторонняя биологическая активность прополиса позволяет все более широко использовать его в медицинской практике. В виду этого становится особенно важным выявление размаха колебаний его биологической активности, поскольку состав прополиса не является постоянным и заметно варьирует в зависимости от окружающей флоры, что, в итоге, может сказаться и на его биологической активности.
Ответ на этот вопрос предполагает глубокое изучение химического состава прополиса и растительных смол, являющихся его первоосновой, и сравнительное изучение их биологической активности.
В результате исследований, проведенных ранее в Институте, было установлено, что основными растениями - прополисоносителями в Европейской части России являются береза, тополь и осина, причем первенствующее положение в этом ряду занимает береза бородавчатая (Betula verrucosa). Этот вид является наиболее распространенным лиственным растением в стране и расселен на очень большой территории, что, очевидно, и обусловливает его доступность медоносным пчелам в большинстве пчеловодных зон. Действительно, как показывает химический анализ, на прополис березового типа приходится и основная часть заготовливаемого в стране продукта.
В виду исключительно важной роли именно этого типа прополиса, он и был нами выбран в качестве основного объекта исследования.
Для сопоставления химического состава и биологической активности прополиса и его предшественника — выделений пазушных почек березы авторы выбрали два вида биологической активности — тесты на торможение роста отрезков колеотгтилей пшеницы и прорастание семян и на антимикробную активность в отношении грамположительных микроорганизмов.
Путем разделения спиртовых экстрактов прополиса и аналогичных экстрактов пазушных почек березы на пластинках с силикагелем в системе бензол-ацетон (8:2) с последующим тестированием элюатоз зон было выявлено, что ростингибирующая активность и в случае прополиса и в случае почек сосредотачивается в одних и тех же зонах разделенных экстрактов, причем наибольшая активность приходится на зоны с рН 0.7—0.8. Изучение состава этих элюатов ранее разработанными нами методами, включая хромато-масс-спектрометрию, показало, что основными компонентами этих зон являются 5-ОКСИ-41,7-диметокси-(1) и 5-окси-41-окси-7-метоксифлаванон (2). Оба соединения содержатся в экстрактах обоих источников в количестве до 5— 7%. Удельная активность обоих флаванонов в тесте как на растяжение отрезков колеоптилей пшеницы, так и прорастание семян горчицы была близка к 5 Ю-5 М.
Другим ростингибирующим компонентом, ответственным за активность менее полярных зон, оказался ацетат — бетуленола (3), являющийся основным сесквитерпеноидным соединением экстрактов обоих исследуе мых источников — прополиса и почек. Это маслообразное соединение также оказалось выраженным ингибитором роста растений, причем характер проявляемого им ингибирования указывает на наличие у него фитотоксических свойств. Этот факт, по-видимому, объясняет наличие аналогичной активности, свойственной прополису и впервые выявленной французским исследователем ГОННЭ.
Помимо этих трех веществ, содержащихся в исследуе мых экстрактах в особенно значительных количествах, в них были идентифицированы и ароматические кислоты: п-окси-(4) и п-метоксибензой-ная (5) и п-кумаровая (6), которые также обнаружили способность тормозить рост при концентрациях Ю-3 М. (10).
Таким образом, подробное изучение одного нз характерных биологических свойств прополиса — подавлять рост и развитие растений привело к идентификации в нем 6 конкретных соединений, обладающих высокой удельной активностью и содержащихся как в прополисе, так и в его источнике — пазушных почках березы. Важной особенностью этих соединений является то, что их биосинтез сцеплен, вследствие чего они появляются и исчезают в почках лишь одновременно, причем пчелы предпочитают сбор тех выделений пазушных почек, которые обогащены этими компонентами.
Нами было также проведено сравнительное изучение и антимикробных свойств прополиса и почек. При аналогичном разделении экстрактов на силикагеле в системе этилацетат-гептан (1:1) итерировании элюатов на грамположительных микроорганизмах, включая устойчивые к антибиотикам штам мы золотистого стафилококка, было установлено, что наибольшей активностью отличаются элюаты зон с рН 0.5— 0.6. Причем, и в этом случае активность для обоих экстрактов приходилась на зоны с одной и той же хроматографической подвижностью. Хромато-масс-спектрометрический анализ тетраметилснлильных производных этой зоны на колонках с 3% Е или 0—17 выявил и для почек березы и для прополиса наличие двух основных групп соединений. Первую группу со значительно большим временем удерживания составляли соединения флавоноидной природы, в числе которых были идентифицированы акацетин, эрмапин и пектолинарингекин; вторая же группа соединений с несколько меньшим временем удерживания была представлена 3 соединениями гликозидной природы, химическое строение которых к настоящему времени еще полностью не выяснено. Помимо этих двух основных типов соединений, в биологически активной антимикробной фракции прополиса была выявлена и п-кумаровая кислота, для которой также была ранее показана слабая антибактериальная активность. (9,10).
Поскольку удельная активность входящих в эту фракцию фла-ноноидных агликонов заметно ниже всей фракции в целом, это служит указанием на принципиальную роль в активности прополиса этой новой гликозидно-связанной группы соединений. Важным и интересным является то, что эти вещества в аналогичных количественных соотношениях присутствуют и в экстрактах пазушных и пробужденных (весенних) почек березы.
Таким образом, основным источником биологической активности прополиса в отношении выбранных нами биотестов являются не специфические продукты биосинтеза медоносных пчел, а защитные выделения растений. Повышение эффективности антимикробной защиты гнезда у медоносных пчел, очевидно, происходило, главным образом, не путем развития способности продуцировать собственные антибиотики, а в выборе наиболее эффективных растений-прополисоносителей и генетическом закреплении механизмов их распознавания.
Сравнительное изучение химического состава другого важного типа прополиса — тополиного, показало, что свойственная ему группа ароматических кислот и флавоноидных соединений отличается от аналогичных веществ березы и прополиса березового типа, главным образом, пониженной степенью гидроксилирования их ароматических колец, в частности, кольце В в случае флавоноидных агликонов. Однако изучение зависимости биологической активности от химического строения в ряду этих соединений показывает, что эти изменения не являются принципиальными для активности. Очевидно, именно это и обусловливает наблюдаемый факт сравнительно однотипной и равной по уровню биологической активности суммарных экстрактов прополиса березового и тополиного типа.
Описываемые факты свидетельствуют о тесной связи защитных систем двух различных видов организмов — насекомых и высших растений, причем растению и в этом случае принадлежит первенствующая роль в биосинтезе особенно эффективных защитных комплексов соединений. Пчелы же являются уникальным видом общественных насекомых, наделенных способностью выявлять такие наиболее эффективные защитные эксудаты растений и накапливать их В количестве, достаточном не только для внутренних потребностей улья, но и для частичного их отбора в интересах человека. (8,9,10).
3.2 ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПРОПОЛИСА
ИЗОЛЯЦИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ 4-ОКСИ-З-МЕТОКСИ
КОРИЧНОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ПРОПОЛИСА
И. ЧИЖМАРИК, И. МАТЕЛ ЧЕХОСЛОВАКИЯ
Для дальнейшего успешного биохимического, фармакологического и клинического исследования прополиса следует, безусловно, знать его точный химический состав. До сих пор найдено в прополисе в общем 19 веществ разной химической структуры.
В прополисе описаны коричная кислота и коричный алкоголь, хризин (КЮСТЕНМАХЕР, ЖОБЕР) « ванилин (ДИТРИХ). Советский исследователь ПОПРАВКО нашел в прополисе изованилин, акацетин, кемферид, рашюцитрин, юверцетин, пиностробин, 5-окси-7,4-диметоксифлавонон : 5,7-диоксигЗ,4-диметоксифлавон, 3,5-диокси-7,4-диметоксифлавон и 5-окси-7,4-диметоксифлавон. Авторы выделили из прополиса и идентифицировали кофейную кислоту, а французские исследователи под руководством V. R. VILLANUEVA идентифицировали в прополисе галангин, хризин, тектохризин, «зальпинин и пиноцембрин.