Предварительные опыты и результаты бумажной и тонкослойной хроматографии показывают, что прополис содержит ещё целый ряд до сих пор не идентифицированных соединений. Поэтому в своем исследовании авторы стремились их определить.
Анализ проводили по следующей схеме. Экстракция : 1000 г прополиса экстрагировали в 2 л безводного бензола без нагревания в течение двух дней. После фильтрации раствор бензола был удален дистилляцией в вакууме и осадок экстрагирован одним литром безводного этилового спирта. Экстракцию вели в течение 24 часов без нагревания. Полученный красно-коричневый раствор подвергли дистилляции для полного удаления жидкости и экстрагировали в 500 мл холодной воды в течение 3 дней. Остаток после экстракции перекристаллизировали в горячей воде. Выделившиеся кристаллы отделили и растворили в 10 мл безводного спирта. Полученный раствор был нанесен на тонкий слой силикагеля и хроматографирован в системе бензол-диоксан-уксусная кислота в соотношении 90 : 25:4. С помощью облучения ультрафиолетовыми лучами было установлено, что хроматограмма содержит 5 соединений. Нами выделенная и описанная кофейная кислота имела полосы при R/ = 0,24.
В зоне с Rf = 0,50 находилось вещество, которое имело синюю флуоресценцию под ультрафиолетовыми лучами и эту зону экстрагировали этиловым спиртом, упаривали и кристаллизовали.
Из 15 таким образом полученных зон спиртовой экстракт был удален сушкой полностью. Полученные мелкие кристаллы после перекристаллизации в горячей воде имели точки плавления 168°. Так как вещество с такой точкой плавления не было еще обнаружено в прополисе, авторы сосредоточились на его идентификации.
Идентификация. Спиртовой раствор выделенного вещества показал характерные химические реакции на присутствие карбоксильной и гидроксильной групп, двойной связи и реакцию, доказывающую присутствие метоксигруппы.
При исследовании спиртового раствора в ультрафиолетовых лучах авторы определили максимум абсорбции гари длине волны 322 тм.
По результатам исследования этого вещества с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии,, инфракрасного света и спектра ядерного магнитного резонанса авторы определили, что оно является 4-окси-3-метокси коричной кислотой, которая в химической литературе называется также феруловой и имеет следующую структурную формулу:
оснз
Правильность предположения была доказана исследованием величины R выделенной кислоты и контрольного раствора кислоты. Оба вещества имели одинаковые величины Rf, характер поглощения ультрафиолетовых и инфракрасных лучей.
Фармакологическое действие. Феруловая кислота отличается антибактериальным действием (грамположительным и грамотрицатель-ным) и способствует бактерицидному и бактериостатическому действию прополиса, что описано уже несколькими авторами.
Кроме того, проявляется в значительной степени вяжущее действие, используемое при лечении трудно заживающих ран при помощи мази, приготовленной из спиртового раствора прополиса, и желчевы-делительное действие, описанное в 1938 г.
Феруловая кислота находится главным образом в млечном соке корня Ferula foetida, в смоле Орорапах chironium, Catalpa ovata и в Ajugaiva. Кроме того, имеется также в Equisetum hiemala, Dahlia variabilis и Berberis amurensis/.
В прополис феруловая кислота попадает в основном из смолы Pinus laricis, где эта кислота была "найдена еще в 1876 г. из Pinus cerobra и смолы елей.
С этих растений пчелы очень интенсивно, главным образом, осенью собирают смолу, как основную составную часть прополиса. Пчела может эту кислоту синтезировать и в качестве вторичного продукта расщепления гликозидов растений, в которых феруловая кислота присутствует как агликон.
Ввиду того, что в пыльце эта ненасыщенная кислота еще . не найдена, обнаружение ее в прополисе служит важным аргументом против теории Кюетенмахера и в пользу того мнения, что прополис собирают пчелы из смолистых выделений почек и коры разных растений. (5,8,9).
4. Влияние на организм.
4.1. Действие прополиса на Pseudomonas Aeroginosa in vitro
Р. И. Анастасиу Ру мыния
По всей вероятности, прополис действует непосредственно, благодаря содержащимся в нем антибиотическим веществам или же катализирует действие спирта. Во всяком случае применение in vitro спиртовых растворов прополиса (при концентрации выше 3—6%) вызывает ингибирование роста РА.
Из вышесказанного вытекает, что эффективны только растворы с высокой концентрацией прополиса. Это значит, что при высокой степени заражения РА спиртовые растворы прополиса целесообразно применять только местно. Об этом свидетельствуют и другие известные свойства спиртовых растворов прополиса — гемостатическое, местноанестезирующее, а также местногрофический и регенерирующий эпителии эффект.
При сравнении микробных штаммов зарегистрированы значительные различия между грамположительными возбудителями (очень чувствительными к прополису) и грамотрицательными, в том числе РА (12) (менее чувствительными). (7).
4.2ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОПОЛИСА НА НЕКОТОРЫЕ ВИРУСЫ РАСТЕНИЙ
Прополис обнаружил несомненно ингибирующее действие на все четыре вируса, использованные в опыте, и оно было довольно сильным. Три вида из этих вирусов обладали круглыми частицами, но несмотря на то что они сходны, их чувствительность была различной. Самая высокая чувствительность была обнаружена у вируса некроза табака, а самая низкая — у вируса мозаики огурца, соответственно, у его штамма, изолированного с Phytolacca; у четвертого вируса частицы имели вид палочек и, по-видимому, их чувствительность к прополису почти подобна чувствительности круглого вируса некроза табака.
Приведенные результаты четко показывают, что прополис не только сокращает число повреждений на засеянных вирусом листьях, но и явно затормаживает размножение вируса во всем растении.
На данном этапе авторы еще не в состоянии объяснить более выраженное действие прополиса при пониженных концентрациях (оптимальные результаты были получены при концентрациях в 10~3 — Ю-7). В этих случаях, речь идет либо о влиянии физиологического состояния растений (опыты были произведены последовательно а не одновременно), либо о действии среды или другого неконтролируемого фактора. Все-таки из последнего опыта можно сделать вывод что прополис сохраняет свою действенность даже в очень низких концентрациях, что может иметь особое практическое значение в случае возможного использования с целью защиты более чувствительных культур, в особенности тепличных, рассады и вообще молодых растений. Ингибирующее действие прополиса на вирусы обладает значительной устойчивостью которая сохраняется в большой мере при более высоких температурах.
Предварительные опыты, произведенные с прополисом продемонстрировали его сильное ингибирующее действие на три вида сферического вируса — соответственно вирус мозаики огурца, изолированный с Phytolacca americana, вирус пятнистости табака и вирус некроза табака, изолированного с бересклета, а также палочкообразный вирус мозаики табака. Прополис сокращает не только число повреждений на засеянных вирусом листьях но, одновременно, явно затормаживает размножение вируса во всем растении. Прополис проявил высокую активность и в случае пониженных концентраций, что может иметь значение для использования этого вещества в практике мероприятий по защите культур. (9,10).
4.3ВЛИЯНИЕ ПРОПОЛИСА НА РЯД ВИДОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И ПЛЕСЕНЕЙ
В работе авторы хотели выявить антимикробное действие прополиса па некоторые виды микроорганизмов. Его аитнмнкробное действие было доказано многими авторами. ЛИНДЕНФЕЛСЕР считает, что он оказывает общее бактериостатическое и фунгистатическое воздействие, главным образом на грамположительные бактерии. Прополис не действовал ни на одну из двух испытанных дрожжевых культур.
Из проведенных опытов установлено, что прополис оказывал бактерицидное действие на большинство испытанных микроорганизмов, в особенности на грамположительные кокки Micrococcus lysodeicticus, Sarcina lutea, Staphylococcus aureus, на грамотрицательные бациллы — Bacillus subtilis, на грамположительные — Corynebacte-rium equi, а также на некоторые виды плесеней — Aspergillus ochra-ceus и дрожжей — Saccharomyces cerevisiae.
Разные концентрации прополиса в этиловом спирте не обнаружили существенного различия — до концентрации 1 : 10, имевшей самую низкую эффективность.
Не установлено разницы между действием прополиса, растворенного в этиловом спирте, и прополиса в растворе этилового спирта, разбавленного водой.
В серии опытов, проведенных для определения термостабильности прополиса, достоверных различий не отмечено. Можно предполагать что прополис является термостабильным веществом. Это его свойство было выявлено и КИВАЛКИНОЙ.
Относительный бактерицидный эффект прополиса соответствует бактерицидному эффекту 16 е пенициллина и 25 е фунгицидина.
Следует отметить, что на результаты проведенных испытаний могло повлиять — скорее отрицательно — одно из свойств прополиса, а именно его растворимость в спирте, по сравнению с его возможной растворимостью в воде. Авторы считаем, что несмотря «а то, что испарения этилового спирта из роликов удалось относительно эффективно избежать (благодаря тому, что верхняя половина чашки Петри опиралась непосредственно на ролики), процесс испарения все же происходил вследствие диффузии раствора в твердой среде. Этим же можно объяснить отрицательный результат полученный при испытании влияния этилового спирта на подопытные виды микроорганизмов. Были использованы максимально-точные методы титрования, так как даже очень небольшая концентрация этилового спирта в жидкой культуре имеет бактерицидное действие.