Сахарный мясо-пептонный агар
- Агар пищевой, ГОСТ 16280-88 – 1,5%
- Мясной бульон – 100 мл
- Пептон, сухой, ферментативный, для бактериологических целей, ГОСТ 13805-76 – 1%
- Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 – 0,5%
- D(+)-Глюкоза, чда, ГОСТ 6038-74 – 1%
Среда применяется для выращивания дрожжевой фазы возбудителей бластомикоза и паракокцидиоидомикоза.
Среда Курунга
- Крахмал (нерастворимый) – 1,0 г
- Желтки куриных яиц – 150 мл
- Белки куриных яиц – 50 мл
- Дистиллированная вода, ГОСТ 6709-72 – 100 мл
Среда применяется для хранения дрожжевой фазы возбудителя гистоплазмоза.
Среда Конверса
- Дистиллированная вода, ГОСТ 6709-72 – 1 л
- Калий фосфорнокислый однозамещенный, хч, ГОСТ 4198-75 – 0,3 г
- Калий фосфорнокислый двузамещенный, 3-водный, чда,
ГОСТ 2493-75 – 0,4 г
- Магний сернокислый, 7-водный, хч, ГОСТ 4523-77 – 0,4 г
- Цинк сернокислый, 7-водный, чда, ГОСТ 4174-77 – 0,2 мл (1% р-р)
- Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 – 1,4 мл (1% р-р)
- Кальций хлорид, 2-водный, ч, ТУ 6-09-5077-83 – 0,003 г
- Натрий углекислый кислый, хч, ГОСТ 4201-79 – 1 мл (1% р-р)
- Аммоний уксуснокислый, хч, ГОСТ 3117-78 – 1,23 г
- D(+)-Глюкоза, чда, ГОСТ 6038-74 – 10 г
Среда применяется для получения сферул возбудителя кокцидиоидомикоза.
Приложение 2
Приготовление рабочих растворов и реагентов
для проведения ПЦР
2.1 Лизирующий буфер с 6 М гуанидинтиоцианатом (ЛБ) – на 50 мл: гуанидинтиоцианат Na – 35,4 г, растворяют в дистиллированной воде, добавляют 1 мл 0,5 раствора ЭДТА и доводят до 50 мл дистиллированной водой. К раствору гуанидинтиоцианата Na добавляют в сухом виде дитиотрейтол (ДТТ) до конечной концентрации 20мМ. На 50 мл раствора гуанидинтиоцианата Na необходимо взвесить 154 мг. Буфер хранят в полипропиленовой посуде при 4-10 оС до 6 месяцев.
2.2 Раствор 4 М гуанидинтиоцианата натрия – навеску гуанидинтиоцианата Na, равную 23,6 г растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до 50 мл. Рекомендуется добавить ДТТ до конечной концентрации 20мМ.
2.3 Раствор для первой отмывки 1 – к 1 мл раствора 1 М Трис-HCl, рН 8,5, добавить 1 мл 5 М раствора натрия хлорида, довести объем до 30 мл дистиллированной водой и добавить спирт этиловый 70 мл. Буфер хранят в полипропиленовой посуде при 4-10 оС – до 6 месяцев.
2.4 Суспензия сорбента (СС) – готовят 50 % (вес/объем) суспензию силикагеля (SiO2) с размером частиц 0,5-10 мкм в деионизованной воде.
2.5 TE буфер рН 7,4: на 100 мл – 1М раствор Трис-HCl, рН 8,0 – 1 мл, 0,5 М раствор ЭДТА – 0,2 мл, деионизованная вода – до 100 мл. Буфер хранят в полипропиленовой посуде при 4-10 оС – до 6 месяцев.
2.6 0,5 М раствор ЭДТА, рН 8,0. 18,61 г соли помещают в химический стакан на 100 мл, добавляют 80 мл дистиллированной воды, интенсивно размешивают на магнитной мешалке и доводят рН до 8,0±0,1 с помощью натрия гидроокиси. Раствор хранят в темной полипропиленовой посуде при температуре (4±2) оС до 3 мес.
2.7 1 М раствор трис-HCl, рН 8,0±0,1. Навеску трис-(оксиметил)-аминометана – 6,5 г помещают в химический стакан на 50 мл, добавляют 25 мл дистиллированной воды. После полного растворения соли доводят дистиллированной водой до 50 мл и выставляют рН 8,0±0,1 с помощью концентрированной соляной кислоты. Раствор хранят при температуре (4±2) оС до 3 мес.
2.8 0,1 М раствор трис-HCl, рН 6,4±0,1. Навеску трис-(оксиметил)-аминометана – 1,21 г помещают в химический стакан на 100 мл, добавляют 50 мл дистиллированной воды. После полного растворения соли доводят дистиллированной водой до 100 мл. Доводят рН до 6,4±0,1 с помощью концентрированной соляной кислоты. Раствор хранят при температуре (4±2) оС до 3 мес.
2.9 5 М раствор натрия хлорида. Навеску натрия хлорида – 2,922 г помещают в химический стакан и добавляют 8 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в стеклянной посуде при температуре (4±2) оС до 3 мес.
2.10 3 M раствор ацетата натрия. Навеску ацетата натрия 40,8 г помещают в химический стакан на 100 мл растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
2.11 Фенол, забуференный Tris-HCl, pH 8,0. Перед употреблением перегнанный фенол достать из холодильника, выдержать при комнатной температуре и расплавить при 68 °С. К расплавленному фенолу добавить равный объем H2O, тщательно перемешать и выдержать раствор до разделения фаз. После этого удалить верхнюю водную фазу. К фенолу добавить равный объем 1 М раствора трис-HCl, рН 8,0±0,1, тщательно перемешать и выдержать раствор до разделения фаз. Удалить верхнюю водную фазу. Затем фенол насыщают равным объемом 0,1 М раствора трис-HCl, рН 8,0±0,1, тщательно перемешивают и выдерживают раствор до разделения фаз до тех пор, пока рН водной фазы не станет > 7,6. Раствор фенола можно хранить при 4 оС до появления розового окрашивания.
Предостережение. При работе с фенолом следует надевать перчатки и очки, так как он является едкой жидкостью и вызывает тяжелые ожоги.
Приложение 3 (справочное)
Лечение особо опасных микозов
Кокцидиоидомикоз
Чувствительность большинства штаммов Coccidioides spp. к антимикотикам: амфотерицин В (МПК 0,03-0,5 мг/л), кетоконазол (0,5-1 мг/л), итраконазол (0,5-1 мг/л), флуконазол (8-32 мг/л, чувствительность зависит от дозы), вориконазол (МПК около 0,125 мг/л).
В лечении кокцидиоидомикоза используются разные системные антимикотики, включая амфотерицин В и три пероральных азольных антимикотика: итраконазол, флуконазол и кетоконазол (табл.2). Отдельные формы инфекции могут потребовать хирургического вмешательства.
Первичная инфекция в форме абортивной острой пневмонии без риска диссеминации обычно не требует лечения. Показаниями к терапии являются сохраняющиеся дольше 6 недель симптомы заболевания, а также изменения корней легких на рентгенограмме или повышение титров РСК выше 1:16. При прогрессирующей острой пневмонии или предполагаемом риске диссеминации назначают амфотерицин по 0,4-0,6 мг/кг в сут до стабилизации состояния больного, а затем по 0,8-1,0 мг/кг в сут через 2 сут. Лечение ведут до общей курсовой дозы в 0,5-1,5 г. В настоящее время также используют флуконазол или итраконазол в дозах 400 мг/сут и более.
При наличии остаточных явлений в легких используют флуконазол по 400 мг/сут в течение 6-12 мес. В то же время больные с единичными небольшими полостями требуют не лечения, а наблюдения до разрешения этих очагов. Увеличивающиеся полости каверны, близкие к плевре, осложнения в виде бактериальной инфекции или кровотечения требуют хирургического вмешательства.
Таблица 2
Схема терапии различных форм кокцидиоидомикоза
| Клиническая форма | Средство выбора | Альтернативная схема |
| Острая легочная | При нетяжелом течении - наблюдение | Флуконазол 400 мг/сут в течение 2-6 мес или итраконазол 400 мг/сут в течение 2-6 мес. |
| Остаточные явления | Флуконазол 400 мг/сут и более в течение 2-6 мес | Флуконазол 400 мг/сут в течение 6-12 мес, хирургическое вмешательство по показаниям |
| Прогрессирующая тяжелая форма | Итраконазол 400 мг/сут и более в течение 2-6 мес | Амфотерицин В 0,4-0,6 мг/сут до курсовой дозы 0,5-15 г |
| Хроническая легочная | Флуконазол 200-400 мг/сут в течение 6-12 мес | Амфотерицин В 0,4-0,6 мг/кг в сут до курсовой дозы 0,5-15 г |
| Диссеминированная без менингита | Амфотерицин В 0,6-1,5 мг/кг в сут до курсовой дозы 2-3 г; флуконазол 400 мг/сут в течение 12 мес при стабильном состоянии | Амфотерицин В с переходом на поддерживающую терапию. Амфотерицин В 1-1,5 мг/кг в сут (при милиарной форме) |
| Кокцидиоидный менингит | Флуконазол 400 мг/сут в течение 2-6 мес или итраконазол 400 мг/сут в течение 2-6 мес, с переходом на поддерживающую терапию | Интратекальное введение амфотерицина В с переходом на поддерживающую терапию |
Хроническая прогрессирующая пневмония в настоящее время является показанием к назначению флуконазола в дозах 200-400 мг/сут. Ранее использовали амфотерицин в дозах 0,4-0,6 мг/кг в сут. При отмене того и другого препарата возможны рецидивы.
При угрожающей пневмонии с выраженной дыхательной недостаточностью, а также при внелегочной диссеминации гриба назначают амфотерицин в дозах 0,6-1,5 мг/кг в сут до курсовой дозы в 2 г. После стабилизации состояния больного в настоящее время предпочитают переход на использование азольных антимикотиков в режиме поддерживающей терапии. Назначают флуконазол, по 400 мг/сут или итраконазол по 200 мг/сут, или увеличенные дозы этих препаратов. Поддерживающая терапия обычно ведется в течение, по крайней мере, 1 года, а иногда и пожизненно.
При изначально стабильном состоянии больных или медленном развитии симптомов начинают сразу с пероральных антимикотиков в тех же дозах.
При кокцидиоидомикозном остеомиелите нередко требуется хирургическое вмешательство для удаления пораженных тканей или дренажа очагов в мягких тканях.
При кокцидиоидомикозном менингите назначают флуконазол или итраконазол по 400 мг/сут или в более высоких дозах. Возможно изначальное лечение амфотерицином В с переходом на флуконазол.
Хирургический метод лечения применяют при ограниченных формах кокцидиоидомикоза легких; положительные результаты хирургического вмешательства отмечены при поражении опорно-двигательного аппарата.
С кокцидиоидомикозом могут сочетаться заболевания, связанные с дефектами иммунитета. Терапия таких заболеваний зависит от интенсивности клинических проявлений. При дефектах клеточного иммунитета полезными оказываются препараты, способствующие их устранению, в сочетании со специфическим лечением.