б) Значение Clostridium в пополнении азотного фонда почвы.
Из анаэробных азотфиксаторов хорошо изучены представители рода Clostridium.
Первым из свободноживущих фиксаторов азота был открыт Clostridium pasterianum. Этот микроорганизм имеет палочковидные клетки длиной 1,5-8 мкм и шириной 0,8-1,3 мкм. Молодые клетки несут перитрихиально расположенные жгутики, старые – образуют споры. При спорообразовании клетки утолщаются в середине или на конце. В присутствии кислорода воздуха Cl. Pasterianum может развиваться только при наличии в среде аэробных бактерий, поглощающих кислород, он малочувствителен к реакции среды и встречается как в кислых (рН = 4,5-5,5), так и в щелочных (рН = 8-9) почвах. Споры его довольно устойчивы: они выдерживают нагревание до 960С в течение нескольких минут.
В качестве источника азотного питания бактерии рода Clostridium могут использовать соли аммония, азотной кислоты и многие содержащие азот органические соединения. При дефиците этого элемента бактерии усваивают молекулярный азот. Источником углерода могут быть различные углеродсодержащие элементы – моно-, ди- и некоторые полисахариды, а также органические кислоты. Освобождающаяся при сбраживании углеводов энергия частично идет на усвоение газообразного азота атмосферы.
Бактерии рода Clostridium считаются слабоактивными фиксаторами азота. Пределом их активности считается связывание от 1 до 3 мг азота на 1 г сброженного сахара (но в лабораторных условиях, используя среды, физиологически оптимальные для этого рода, удалось повысить их активность до 10-12 мг азота на 1 г сброженного сахара [Мишустин Е.Н., Емцев В. Т.; 1987].
То есть в целом вклад Clostridium в азотный фонд почв невелик, но учитывая широкую распространенность бактерий этого рода в различных типах почв, полностью списывать его со счетов нельзя.
в) Значение других видов свободноживущих микроорганизмов в накоплении азота в почве.
Бактерии рода Beijerinckia, относящиеся к семейству Azotobacteriaceae, близки по свойствам к азотобактеру, отличаясь от него значительной кислотоустойчивостью, кальцифобностью и некоторыми другими свойствами. Они могут расти даже в среде с рН около 3. Эти бактерии широко распространены в кислых почвах субтропической и тропической зон. Реже они встречаются в почвах зоны умеренного климата. На территории бывшего СССР бактерии рода Beijerinckia найдены в красноземах Грузии. В окультуренных кислых почвах юга содержится больше клеток Beijerinckia, чем в целинных. Целинные луговые почвы в свою очередь богаче бактериями рода Beijerinckia, чем лесные.
Как показали исследования последнего времени, в почве могут находиться азотфиксирующие бактерии рода Klebsiella, представляющие собой грамотрицательные, подвижные с перитрихиальным расположением жгутиков, факультативно-анаэробные палочки. Они выносят довольно низкое значение рН и в большом количестве встречаются в лесных подзолистых почвах. В зоне умеренного климата они встречаются и под травянистой растительностью.
Бактерии рода Erwinia, населяющие надземную часть травянистых растений, также способны фиксировать молекулярный азот.
К азотфиксаторам также относятся и некоторые расы Pseudomonas fluorescenses (семейство Pseudomonadaceae). Этот аэробный микроб богаче представлен в почвах северной зоны.
К активным азотфиксаторам также относятся и аэробные цианобактерии. Можно считать, что все микроорганизмы этой группы, обладающие гетероцистами, способны фиксировать молекулярный азот. В почвах РФ обнаружено более 100 видов и разновидностей гетероцистных форм цианобактерий; из азотоусваивающих наиболее распространены представители рода Nostoc.
Цианобактерии распространены во всех почвенно-климатических зонах. Однако они предпочитают нейтральную реакцию среды, и поэтому их численность и видовой состав существенно возрастают в нейтральных почвах южной зоны. Многие цианобактерии живут в симбиозе с другими организмами (например, с грибами, образуя при этом лишайники). В неорошаемых культурных почвах наиболее благоприятные периоды для роста цианобактерий бывают весной и осенью, то есть в периоды увлажнения почвы, а в поливных, кроме того, и после орошения пашни.
Вклад свободноживущих азотфиксаторов в азотный фонд почвы весьма существенен. До последнего времени считали, что деятельность этих микроорганизмов не имеет особого значения в азотном питании растений. Однако длительные опыты опровергли эту точку зрения. Так, показано, что без применения азотных удобрений и без посева бобовых можно получить урожаи зерновых культур, для создания которых требуется внесение до 50 кг азота на 1 га. При этом к возможным источникам пополнения азота относятся деятельность свободноживущих азотфиксаторов и отчасти поступление этого элемента из атмосферы с дождевыми водами.
По материалам многолетнего опыта МСХА, на делянках бессменной ржи ежегодное азотонакопление при известковании почвы составило 28 кг/га, а на неизвесткованном фоне, где условия для азотфиксаторов были хуже – в 2,5 аза меньше.
По данным академика ВАСХНИЛ И. С. Шатилова, в неудобряемых дерново-подзолистых почвах в год связывается 19 кг азота, а в удобряемых – 32-37 кг/га. Данные С. М. Гуревича свидетельствуют о том, что на типичных черноземах без выращивания бобовых культур в год связывается до 56 кг азота на 1 га.
Микроорганизмы-азотфиксаторы, находящиеся на поверхности растений и использующие органические выделения растительных тканей, фиксируют в год 2-10 кг азота на 1 га.
3. Симбиотические азотфиксирующие микроорганизмы: значение клубеньковых бактерий в агротехнике бобовых культур
Симбиотические азотфиксирующие микроорганизмы были выделены М. Бейеринком в 1888 году из корневых клубеньков (бородавчатых наростов) бобовых растений. Микроорганизмы назвали клубеньковыми бактериями, и было установлено, что они вызывают образование клубеньков, в которых осуществляется фиксация азота атмосферы. Бактерии в клубеньках питаются органическими соединениями, синтезированными растениями, а растение получает из клубеньков связанные соединения азота. Таким образом, между бактериями и растениями устанавливаются симбиотические взаимодействия.
Клубеньковые бактерии представляют собой грамотрицательные палочки 0,5-0,9 мкм шириной, 1-3 мкм длиной, подвижные, монотрихи с полярным с полярным или субполярным расположением жгутиков или перитрихи, аэробы. Спор не образуют. Быстрорастующие формы относятся к роду Rhizobium, медленнорастущие – к роду Bradyrhizobium.
Источником азота для клубеньковых бактерий служат разнообразные соединения – соли аммония и азотной кислоты, многие аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и т.д. Обычно клубеньковые бактерии фиксируют азот в симбиозе с растением. Однако на специальных питательных средах при отсутствии кислорода чистые культуры Rhizobium также способны усваивать некоторое количество молекулярного азота.
Клубеньковые бактерии используют разнообразные углеводы, в том числе и некоторые полисахариды (декстрин, гликоген). При усвоении углеводов в процессе жизнедеятельности некоторых видов образуются кислоты. Бактерии потребляют многие органические кислоты и многоатомные спирты.
Лучше развиваются клубеньковые бактерии в питательной среде с витаминами группы В. Ряд витаминов (тиамин, В12, рибофлавин) и ростовые вещества микроорганизмы синтезируют сами.
Для большинства культур клубеньковых бактерий оптимальное значение рН среды находится в пределах 6,5-7,5, а при рН 4,5-5 и 8 их рост приостанавливается. Однако встречаются культуры, относительно устойчивые к кислой среде и образующие клубеньки в почвах с рН = 5. Оптимальная температура для большинства культур около 24 – 260C, при температуре ниже 50С и выше 370С рост прекращается.
Внедрение клубеньковых бактерий в корень бобового растения-хозяина может осуществляться двумя путями: через верхушку корневого волоска или около его конца. У некоторых бобовых растений, например у арахиса, бактерии проникают через «расщелины» в основаниях боковых ответвлений корня. При таком инфицировании растение может быть заражено большинством видов клубеньковых бактерий, и можно говорить о низкой специфичности данного бобового растения. Бобовые растения, инфицируемые через корневые волоски, проявляют обычно высокую специфичность в отношении вида клубеньковой бактерии-симбионта.
Первый признак инфицирования растения – своеобразное изменение формы корневых волосков, которые изгибаются в виде ручки зонтика. Степень искривления волоска зависит от вида бобового растения, активности заражающего штамма, а также места проникновения бактерий. Искривление корневого волоска, по-видимому, объясняется тем, что прикрепившиеся к корневому волоску бактерии останавливают отложение плотного бета-слоя стенки клетки корневого волоска лишь в месте своего прикрепления, а образование этого слоя на противоположной стороне волоска продолжается. В результате корневой волосок сильно закручивается и бактерии оказываются внутри завитка.
В корневом волоске бактерии образуют так называемую инфекционную нить. Последняя представляет собой гифообразную слизистую массу, в которую погружены размножающиеся клетки клубеньковых бактерий. Нить передвигается к основанию волоска и клеткам эпидермиса. Такой путь, равный 100-200 мкм, она проходит за 1-2 суток. Затем нить из корневого волоска проникает через клетки коры в паренхиму.
После внедрения в растительные клетки инфекционная нить покрывается целлюлозной оболочкой, которая формируется из целлюлозной оболочки клетки, вероятно, для изоляции клубеньковых бактерий. Когда на пути инфекционной нити встречаются тетраплоидные клетки, часть бактерий переходит из нити в цитоплазму и начинает там размножаться. После инфицирования клубеньковыми бактериями растительная клетка, а также соседние незараженные начинают активно делиться. Усиленное размножение инфицированных клеток и находящихся под их стимулирующим влиянием (при участии ростового вещества) соседних незараженных клеток приводит к формированию ткани клубенька. Обычно инфекция распространяется через тетраплоидные клетки, а кора и проводящие сосуды клубенька образуются из диплоидных клеток.