Клетки клубеньковых бактерий, перешедшие в цитоплазму растительных клеток, растут, делятся, а затем трансформируются в своеобразные образования – бактероиды. Этим заканчивается процесс инфицирования – приблизительно через 3-4 недели после заражения. Бактероиды в 3-5 раз больше по размерам, чем обычные клетки, причем их форма меняется в зависимости от вида бобового растения – от шаровидной и грушевидной до вильчатой и ветвистой. Бактероиды не делятся, они составляют до 50% массы клубенька.
Ткань клубенька, заполненная бактероидами, обычно приобретает красноватую окраску благодаря пигменту леггемоглобину, родственному гемоглобину. Такая окраска характерна для клубеньков, активно фиксирующих азот. Леггемоглобин выявляют уже на второй день после образования клубенька, а фиксацию азота – на четвертый день.
По мере старения и дегенерации клетки отмирают. Определенную роль в этом процессе играет опробковение клеток сосудистой системы, задерживающее обмен питательными веществами между растением-хозяином и клубеньком. В клетках клубеньков появляются вакуоли, ядро перестает окрашиваться, а бактероиды лизируются. Лизис бактероидов по окончании активной жизни клубеньков обычно совпадает с с некрозом клубеньков, наступающим после цветения растения-хозяина.
У однолетних растений клубеньки также однолетние, у многолетних клубеньки могут функционировать в течение ряда лет. К концу сезона бактероидная ткань клубеньков разрушается, но клубеньки не отмирают, и на следующий год вновь начинают функционировать.
Количество клубеньков на корнях бобовых растений всегда более или менее ограничено. Клубеньки содержат больше азота, чем остальные части растения. Причем фиксация азота атмосферы осуществляется только в бактероидах, и около 90% связанного азота переходит из них в виде ионов аммония в цитоплазму клеток бобового растения. Передача связанного азота из тканей клубенька в наземную часть растения происходит в период, когда бактероиды жизнеспособны. Определенное количество усвоенного растениями азота выделяется корнями в почву с продуктами корневых выделений, например, с аминокислотами (аспарагиновой кислотой).
Эффективность азотфиксации симбиотической ассоциации бобовое растение – клубеньковые бактерии определяется наличием у клубеньковых бактерий целого комплекса симбиотических признаков:
· вирулентности – способности клубеньковых бактерий входить в контакт с корневой системой бобовых растений, проникать в ткани корня, размножаться в них и индуцировать образование клубеньков;
· азотфиксирующей активности – способности связывать азот атмосферы при помощи специальной ферментативной системы и превращать его в ионы аммония;
· эффективности – способности увеличивать урожай и содержание белка у бобового растения-хозяина за счет передачи растению фиксированного азота и синтезированных биологически активных веществ;
· конкурентоспособности – способности внесенного в почву определенного штамма клубеньковых бактерий образовывать клубеньки в присутствии других штаммов того же вида;
· специфичности – способности вступать в эффективный симбиоз с определенным набором сортов и видов бобовых растений.
Обычно почвы содержат в достаточно большом количестве клубеньковые бактерии тех видов бобовых растений, которых много в составе дикой флоры данной местности или которые длительное время там культивируются. Если в данной местности не произрастает определенный вид бобовых, то и свойственные ему клубеньковые бактерии отсутствуют. Поэтому для обеспечения эффективного симбиоза семена бобовых перед посевом заражают высокоактивными штаммами клубеньковых бактерий, специфичных для данного растения.
На количество клубеньковых бактерий в почве влияют ее свойства и состояние. Например, в нейтральных почвах бактерии размножаются лучше, чем в кислых, здесь часто встречаются активные формы. Окультуривание почв, особенно с внесением органических удобрений, улучшает условия для размножения клубеньковых бактерий.[Емцев В. Т., Мишустин Е. Н.; 2004]
В агротехнике бобовых культур большое значение имеет применение бактериальных препаратов рода Rhizobium, особенно если бобовые впервые высеваются на данном поле. После известкования почв высокими нормами известковых удобрений, увеличивающих рН на 1,5-2 единицы, целесообразна инокуляция всех бобовых культур более активными штаммами Rhizobium, так как на кислых почвах спонтанные штаммы обладают пониженной активностью.
Также для симбиотической азотфиксации очень важную роль играют микроудобрения, особенно бор и молибденсодержащие. О значении этих элементов говорилось в первой главе курсового проекта. Недостаток микроудобрений резко снижает, а иногда исключает фиксацию азота воздуха.
Все бобовые культуры охотнее используют минеральные формы азота, чем азот воздуха. Однако азотные удобрения угнетают азотфиксацию тем сильнее, чем выше норма азота. При благоприятных условиях симбиоза под зерновые бобовые культуры не следует вносить азотные удобрения, а под многолетние бобовые травы – лишь в качестве «стартовых» доз перед посевом, и в качестве подкормки на второй год выращивания [Ягодин Б. А., Демин В. А. и др.; 1988].
Таким образом, для научно обоснованного определения видов и норм удобрений под бобовые культуры необходимо не только знать каково содержание питательных веществ в почве данного поля, но также учитывать возможность обеспечения оптимальных условий для симбиотической азотфиксации. [Посыпанов Г. С. и др.; 1997]
4. Методы исследования биологической азотфиксации
В настоящее время существует несколько методов изучения биологической азотфиксации.
Метод выращивания на питательных средах применим в лабораториях. В данном случае бактерии-азотфиксаторы выращивают на средах с различной рН реакцией, содержанием элементов питания, температурными условиями и т.п. В данном случае возможно выяснить при каких условиях процесс азотфиксации идет наиболее оптимально, чтобы затем учитывать это в практике сельского хозяйства. Количество поглощенного азота можно учитывать с помощью метода меченых атомов. Однако недостатком этого метода является то, что он далек от производственных условий, и он является скорее общебиологическим.
Полевой и вегетационный методы исследований значительно ближе к производственным условиям. В данном случае можно проследить динамику азотфиксации на разных типах почв при различных температурных режимах, освещенности, влажности, реакции среды. Эти методы исследований позволяют определить оптимальные для азотфиксации типы почв, подобрать оптимальные растения для симбиоза с бактериями - симбиотическими азотфиксаторами, проследить динамику содержания биологического азота в почве после уборке бобовых культур, и подобрать те растения, которые будут следовать за ними в севообороте, рассчитывать дозы азотных удобрений для тех культур, которые будут следовать за бобовым предшественником.
Весьма важными для повышения уровня биологической азотфиксации являются генетические исследования, начатые в конце 50-х годов прошлого столетия. Генетико-селекционные основы азотфиксирующего симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями впервые в отечественной литературе были представлены в монографии «Генетика симбиотической азотфиксации с основами селекции», вышедшей в 1998 году под редакцией И. А. Тихоновича и Н. А. Проворова. Авторы отмечают, что многие растения, грибы и животные могут вступать в симбиоз с азотфиксаторами, что существенно расширяет экологические возможности как микросимбионта (который уходит от конкуренции с сапрофитной микрофлорой и получает доступ к легкоусвояемым источникам питания), так и хозяина (для которого открывается возможность жить в условиях дефицита или даже полного отсутствия связанного азота). [по Ягодину Б. А., 2004]
5. Пути повышения эффективности биологической азотфиксации
а) Агротехнические мероприятия.
О некоторых из агротехнических мероприятий уже говорилось в предыдущих главах курсового проекта. В этом разделе мы обобщаем информацию о них.
Итак, для создания оптимальных условий для биологической азотфиксации необходимо соблюдать следующие мероприятия:
1. Создание оптимальных условий в почве для размножения и развития бактерий-азотфиксаторов. Сюда входят: изменение реакции среды до оптимальной за счет известкования, подбор необходимой структуры, либо улучшение ее за счет внесения органических удобрений, по возможности обеспечение почвы влагой в засушливых регионах, создание фона элементов питания, необходимых азотфиксаторам (в особенности по микроэлементам);
2. Корректировка доз азотных удобрений с учетом азотфиксирующей способности бактерий. Как уже говорилось выше, внесение минерального азота способно существенно снизить или даже свести на нет биологическую фиксацию молекулярного азота атмосферы. Поэтому в ряде случаев возможен даже полный отказ от внесения азотных удобрений (например, под зерновые бобовые культуры)
б) Применение бактериальных препаратов в земледелии
Биологической альтернативой минеральным азотным удобрениям является биологическая фиксация молекулярного азота атмосферы. Как известно, азотные удобрения стали очень дорогими из-за сокращения добычи ископаемого топлива, а кроме того, в последнее время повышается общественно-политическая озабоченность возможностью химических загрязнений, в частности минеральным азотом, окружающей среды. Следовательно, внимание в настоящее время концентрируется на азотфиксации как альтернативе удобрениям.