2.1.5. Для выявления общих черт в строении более далеких гомологов PG-рецепторов проведено сравнение последовательностей типичных представителей семейства G-белок-связывающих рецепторов.
С помощью программы PSI-BLAST получен список белков — более далеких гомологов EP3-рецептора человека. Для построения выравнивания и филогенетического древа из него взяты первые 100 белков (E Value меньше 10 -66). Все они являются представителями класса А G-белок-связывающих рецепторов. Эти белки принадлежат уже не только млекопитающим (список белков и организмов, а также множественное выравнивание см. в Интернете, http://kodomo.cmm.msu.ru/~venel/index.html). Стоит отметить, что из всех простаноидных рецепторов в эти 100 белков не вошли DP-рецепторы, EP1-рецепторы и EP3-рецептор овцы.
Множественное выравнивание этих белков так же, как и в пункте 2.2, значительно отличалось от результатов, представленных в базе данных и статье [2] (изначально оно содержало только 1 консервативную аминокислоту — цистеин-91). Поэтому оно тоже было отредактировано вручную (путем поиска мотивов, указанных в статье [10]), после чего число консервативных аминокислот в нем стало равно 6 (рис. 3).
2.1.6. По результатам проведенных выравниваний построены филогенетические деревья. При этом последовательность EP3-рецептора овцы была удалена, так как она содержит только 2 трансмембранных участка: 4-ый и 5-ый. Присутствие в выравнивании такой короткой последовательности сильно осложнило бы работу программы, строящей деревья, и могло бы привести к искаженным результатам.
Филогенетическое древо PG-рецепторов (рис. 4) показывает, что эти белки в соответствии со степенью сходства их последовательностей можно разделить на 2 группы:
1) EP2-, EP4-, PD- и PI-рецепторы и
2) EP1-, EP3-, PF- и TA-рецепторы.
Внутри каждой из групп видно деление на более мелкие группы, в каждую из которых входят рецепторы одного конкретного типа. То есть рецепторы одного типа, встречающиеся у разных животных, более близки друг к другу, чем разные рецепторы, принадлежащие одному организму.
Филогенетические деревья для EP-рецепторов (рис. 5) и 100 представителей семейства родопсиновых рецепторов так же показывают, что рецепторы одного типа, встречающиеся у разных животных, более близки друг к другу, чем разные рецепторы, принадлежащие одному организму. Для большей наглядности второе древо сокращено до 47 белков (каждый вид белка представлен не более 2 раз — из 2 разных животных); оно выставлено в Интернете (http://kodomo.cmm.msu.ru/~venel/rhodfam_tree.html).
Все вышесказанное позволяет предположить, что создание высокоселективных агонистов или антагонистов к какому-либо одному виду PG-рецепторов является осуществимой задачей. Также можно предположить, что эти агонисты/антагонисты будут одинаково действенны для данного вида рецептора, вне зависимости от вида животного. Это значит, что при разработке лекарств для человека можно будет проводить исследования на других животных (мышах, крысах).
2.2. Изучение белковой последовательности EP4-рецептора человека.
2.2.1. С помощью программы BLAST проведен поиск гомологов EP4-рецептора человека по его отдельным участкам:
· C-концу (1 – 19 аминокислоты) и
· N-концу (333 – 488 аминокислоты).
Найдено, что достаточно близкими его гомологами (E Value меньше 1/1000) являются (в порядке уменьшения сходства)
· для C-конца — EP4-рецепторы мыши, крысы и кролика;
· для N-конца — EP4-рецепторы кролика, мыши и крысы.
Таким образом, можно утверждать, что последовательности C- и N-концов EP4-рецептора человека уникальны для EP4-рецепторов.
2.2.2. В базе данных Pfam представлена доменная структура EP4-рецептора и приводятся выравнивания для отдельных доменов. Основной домен EP4-рецептора (аминокислоты с 44 по 329) носит название 7tm_1 и имеется у всех представителей семейства родопсиновых рецепторов. Состоит он из 7 трансмембранных α-спиралей, соединенных внемембранными участками.
Приводится выравнивание 7tm_1-домена EP4-рецептора человека с 7tm_1-доменом различных представителей семейства родопсиновых рецепторов.
Также выделены
1) сигнальный участок — аминокислоты с 1 по 43, находящиеся вне клетки, и
2) участок, состоящий из сравнительно немногих видов аминокислот (low complexity region), состоящий из аминокислот с 389 по 405.
Выравнивается каждый из этих двух участков EP4-рецептора человека с соответствующими участками EP4-рецепторов кролика, крысы и мыши, а также четырех неаннотированных белков (из базы данных EMBL). 3 из них являются EP4-рецепторами собаки, шимпанзе и макаки, а 4-ый — это неизвестный белок мыши, очень похожий на белок EP4-рецептора. Это приводит к тому же выводу, что и в предыдущем пункте: серьезное сходство последовательностей С- и N-конца проявляется только у рецепторов одного подтипа, принадлежащих разным животным.
2.2.3. Для выявления возможного сходства аминокислотных последовательностей тех участков, которые важны для связывания рецептора с G-белком, выполнено множественное выравнивание (с последующим ручным редактированием) последовательности EP4-рецептора человека с последовательностями других представителей семейства G-белок-связывающих рецепторов, которые, как и EP4-рецептор, связываются с Gs-белком. Взяты последовательности рецепторов к фолликулостимулирующему гормону, лютеинизирующему гормону, тиреотропному гормону, меланокортину МС3, вазопрессину М2, серотонину 5НТ4, аденозину А2А; b1-рецептора к адреналину, Н2-рецептора к гистамину и D1-рецептора к дофамину. Все эти белки являются белками человека.
Консервативными являются 9 аминокислотных остатков (рис. 6). Находятся они в трансмембранных участках белков. Значительного сходства аминокислотных последовательностей тех участков, которые важны для связывания с G-белком, не наблюдается. Это значит, что основную роль при связывании с G-белком играет пространственная структура соответствующих участков, а не непосредственно аминокислотная последовательность.
2.2.4. Выполнено парное выравнивание белковых последовательностей EP4-рецептора человека и родопсина быка — единственного представителя класса А G-белок-связывающих рецепторов, для которого есть данные рентгеноструктурного анализа.
В данных двух белковых последовательностях совпадают 47 аминокислотных остатков. Они не собраны в крупные группы, а рассредоточены по всей длине белков. То есть сходство последовательностей не настолько велико, чтобы на это можно было серьезно опираться при построении трехмерной модели EP4-рецептора. К тому же, трехмерная структура известна только для неактивной формы родопсина, в то время как для фармацевтических целей важна активная форма белка. Также необходимо учесть, что структура внеклеточных петель родопсина, возможно, значительно изменена: она определялась прежде всего контактами в кристалле [8].
2.2.5. Сравнение полученных результатов с базой данных по G-белок-связывающим рецепторам (GPCRDB).
В GPCRDB приведены множественные выравнивания для различных групп G-белок-связывающих рецепторов. Выравнивание представителей класса А содержит 1122 белковых последовательностей (включая неаннотированные — из базы данных EMBL). Стоит отметить, что представлены не целые последовательности, а только фрагменты с наибольшим сходством — в основном, трансмембранные, так как вероятность мутации в трансмембранной части ниже, чем во внутри- или внеклеточной части белка.
Авторы пишут о необходимости ручного выравнивания с учетом всех известных экспериментальных данных, если речь идет о большом числе белковых последовательностей [9].
Также в GPCRDB представлены трехмерные модели многих белков, в том числе и EP4-рецептора человека. Множественные выравнивания и трехмерные модели созданы с помощью программы WHAT IF. Она позволяет учесть многочисленные данные, в том числе и трехмерную структуру родопсина, но тем не менее полученный результат не может считаться достаточно точным для фармацевтических целей (об этом предупреждают сами авторы моделей). Пользование программой WHAT IF платное.
Кроме того, в GPCRDB приводятся описания и результаты других методик исследования, способных выявлять более сложные взаимосвязи и закономерности, чем просто анализ расположения консервативных позиций в множественном выравнивании. Далее приводится описание этих методик (в соответствии со статьей [9]).
Для анализа функциональной значимости отдельных аминокислотных позиций выравнивания используется расчет для каждой позиции двух величин: энтропии и вариабельности. Энтропия в позиции p (Sp) определяется так:
20
Sp = - ∑ fpi * ln (fpi),
i=1
где i пробегает все 20 видов аминокислот, а fpi — это относительная частота аминокислотного остатка i в позиции p выравнивания. Значение Sp максимально,
если fp1 = fp2 = ... = fp20; минимально (то есть равно нулю), если в позиции встречается только 1 вид аминокислотных остатков. Таким образом, Sp можно назвать мерой информации, содержащейся в позиции p выравнивания.
Вариабельность в позиции p (Vp) определяется как число разных видов аминокислот, встречающихся в позиции p не менее чем в 0,5 % последовательностей. Можно сказать, что Vp является мерой свободы, или хаоса, в позиции p выравнивания.
Все аминокислотные позиции разделяются на 5 блоков в зависимости от своей энтропии и вариабельности (не указано, какие значения приняты пороговыми):
1) блок 11 содержит позиции с низкой энтропией и низкой вариабельностью, которые формируют главный функциональный сайт (для G-белок-связывающих рецепторов —участок связывания с G-белком) или играют важную структурную роль (например, образуют дисульфидные мостики);