Методические рекомендации разработаны: д б. наук Р. Т. Тухватулиным 1 (стр. 2 из 4)
На рисунке 1 приведена схема, поясняющая принцип определения показателей ОАЭ по фотометрической кривой и зависимости напряжения питания вибратора от времени. В случае, когда эритроциты полностью агрегированы, оптическая плотность исследуемой пробы крови минимальна и постоянна во времени (участок 0 -1). При включении напряжения и начале вибрации увеличение оптической плотности крови происходит не сразу (участок 1-2), а начиная с некоторой величины - Uо (точка - 2).
Микроскопированием установлено, что увеличение оптической плотности обусловлено началом разрушения агрегатов и, следовательно, по величине Uо можно судить об их минимальной механической прочности. Дальнейшее увеличение напряжения питания вибратора приводит к еще большему разрушению агрегатов и связанному с этим уменьшению прозрачности исследуемой пробы крови (участок 2 - 3). Величина напряжения Ud, начиная с которой дальнейшее возрастание разрушающих усилий не приводит к увеличению оптической плотности исследуемой пробы крови (точка 3), характеризует максимальную механическую прочность эритроцитарных агрегатов. Это обусловлено тем, что при Ud все агрегаты разрушены до отдельных эритроцитов, фотометрическая кривая при этом выходит на плато, соответствующее полной дезагрегации эритроцитов (участок 3 - 4). После прекращения разрушающих воздействий (точка 4) начинается процесс спонтанной агрегации эритроцитов (участок 4-5), который заканчивается полной их агрегацией. Фотометрическая кривая при этом выходит на плато (участок 5 - 6).
Скорость спонтанной агрегации эритроцитов характеризуется величиной, обратной полупериоду агрегации эритроцитов - t. Величина полупериода агрегации определяется временем, в течение которого амплитуда фотометрического сигнала изменяется на 50 % [5]. За 100 % изменение амплитуды фотометрического сигнала принимается расстояние - А (мм) от плато на фотометрической кривой, соответствующее полной дезагрегации (участок 3 - 4), до плато, соответствующего полной агрегации эритроцитов (участок 5 - 6).
Рис. 1. Схема, поясняющая принцип определения показателей обратимой агрегации эритроцитов. I - зависимость оптической прозрачности крови от времени в процессе дезагрегации и спонтанной агрегации эритроцитов; II - зависимость напряжения питания вибратора от времени.
На основании измеренных значений показателей ОАЭ расчетным путем определяют индекс агрегации - Ia = Ud / t, характеризующий соотношение агрегационных и дезагрегационных процессов и интегральный коэффициент агрегации - К = Uo Ud A / t.
Количественную оценку биологической активности экстрактов торфов и сапропелей выражают в виде безразмерной величины - степени биологической активности (СБА) экстрактов торфов и сапропелей. СБА = 100 (Рк – Ро)/Рк, где соответственно Рк и Ро - значения тест - параметра контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы.
СБА определяют по изменению параметров ОАЭ за 10-ти минутный (в экспрессном варианте) период экспозиции.
Перечень необходимого оборудования для количественного определения биологического активности экстрактов торфов и сапропелей в лабораторных условиях представлен в таблице 1
| Таблица 1 Перечень необходимого оборудования для количественного определения биологического активности НЧ в лабораторных условиях | ||
| № п.п. | Оборудование | ТУ, ГОСТ |
| 1. | «Стационарный световой анализатор параметров обратимой агрегации эритроцитов» | ТКМА 94.1112.001 |
| 2. | Холодильник бытовой, обеспечивающий замораживание воды (-18 ± 1оС) и хранение проб (+1 +2 °С). | |
| 3. | Часы сигнальные | ТУ 25-07-57 или аналоги |
| 4. | Весы лабораторные общего назначения | ГОСТ 24104 или аналоги |
| 5. | Шкаф сушильный | |
8 Вспомогательные устройства и лабораторная посуда
Перечень необходимых вспомогательных устройств и лабораторной посуды для количественного определения биологической активности экстрактов торфов и сапропелей представлен в таблице 2.
| Таблица 2 Перечень необходимых вспомогательных устройств и лабораторной посуды для количественного определения биологической активности экстрактов торфов и сапропелей | |||
| № п.п. | Оборудование | ТУ, ГОСТ | Количество |
| 1. | Пробирка типа Эппендорф коническая микроцентрифужная с крышкой на 1.5 мл. используется для всех видов лабораторных исследований как транспортно сохраняющая тара при отсроченных отборах проб | 200 | |
| 2. | Штатив-бокс для пробирок типа Эппендорф 1,5 мл (72 гнезда) | 1 | |
| 3. | Пипетка вместимостью 1.0 мл ± 1,0% (1000 мкл) | ГОСТ 29227 | 1 |
| 4. | Пипетка автоматическая дозатор любого типа объемом 0.02 мл ± 1,0% (200 мкл) | 1 | |
| 5. | Пипетка автоматическая дозатор любого типа объемом 0.002 мл ± 1,0%; (20 мкл) | 1 | |
| 6. | Бюксы с притертой пробкой для отбора и хранения проб и реактивов вместимостью 10, 50, 100мл | 10 | |
| 7. | Стаканы стеклянные лабораторные вместимостью 10, 50 мл | ГОСТ 25336 | |
| 8. | Шприц 5 мл | 1 | |
| 9. | Ножницы | 1 | |
| 10. | Катетер для инъекций Æ 1 мм | 1 | |
Перечень необходимых реактивов и материалов для количественного определения биологической активности экстрактов торфов и сапропелей в лабораторных условиях представлен в таблице 3.
| Таблица 3 Перечень необходимых реактивов и материалов для количественного определения биологического активности НЧ | ||
| № п.п. | Реактивы и материалы | ТУ, ГОСТ |
| 1. | Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
| 2. | Щелочь (натрия гидроокись) | ГОСТ 4328 |
| 3. | Спирт этиловый | ТУ 6-091710 |
| 4. | Кислота серная | ГОСТ4204 |
| 5. | Калий двухромовокислый (K2Cr2O7) [6, 7] | ГОСТ 4220-75 |
| 6. | Сода пищевая | |
| 7. | Гепарина раствор для инъекций (амп. 5т ЕД/мл 5мл № 1) | |
| 8. | Физиологический раствор для теплокровных животных | |
| 9. | Бумажные фильтры обеззоленные типа ФОБ | ТУ 6-09-1678 |
| 10. | Бумага индикаторная универсальная для измерения рН | |
| 11. | Водная дисперсная система исследуемого объекта | |
| 12. | Лабораторные животные (мыши, крысы) | |
10 Условия безопасного проведения работ
10.1. При работе с химическими веществами необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТ 12.4.021.
10.2. Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце дня проводится влажная уборка рабочих поверхностей.
10.3. Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.
10.4. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
10.5. Используемая в качестве тест - системы кровь лабораторных животных не патогенна, однако после каждого анализа необходимо промыть всю использованную посуду, ополоснув дистиллированной водой.
10.6. Хранить тест-систему в холодильнике при температуре от +2 до - +4° С (следует беречь тест-систему от замораживания, нагревания и резкой смены температуры).
11 Требования к квалификации лиц, проводящих биотестирование
Определение степени биологической активности экстрактов торфов и сапропелей по настоящей методике выполняется оператором с квалификацией лаборант, имеющим опыт работы с лабораторными животными.
Настоящий документ устанавливает методику количественного определения биологической активности экстрактов торфов и сапропелей с использованием в качестве тест – системы агрегатов эритроцитов крови лабораторных животных.
11\1. Содержание лабораторных животных осуществлялось в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных. Животные содержались на стандартном лабораторном рационе в условиях свободного доступа к пище и воде. Все манипуляции с животными осуществлялись в осенне-зимний период, в первой половине дня. Экспериментальные исследования проведены в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г «Об утверждении правил лабораторной практики», Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2005 г).
12 Условия выполнения измерений
В лабораторных условиях биотестирование проводят в соответствии с требованиями по эксплуатации прибора «Стационарный световой анализатор параметров обратимой агрегации эритроцитов» ТКМА 94.1112.001 и с ГОСТ 15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов. Температура окружающего воздуха в лаборатории от 18 до 25°С. Относительная влажность воздуха 80±5%. Атмосферное давление 84-106 кПа (630-800 мм рт. ст.). При использовании электроприборов частота переменного тока 50 ± 1 Гц. Напряжение сети 220 ± 10 В. Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничивается особыми требованиями.