13 Подготовка к проведению измерений
Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования должна обеспечивать подготовку посуды, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки доставленных в лабораторию проб и определения степени их биологического активности. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ в исследуемую пробу.
13.1 Подготовка посуды для отбора, хранения проб и биотестирования
Обычно используют посуду из стекла, либо одноразовые пробирки типа Эппендорф. Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Стенки посуды осторожно смачивают хромовой смесью (смесью бихромата калия и серной кислоты), через 2 - 3 часа тщательно промывают водой, нейтрализуют раствором пищевой соды и промывают 3 - 4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не допустимо использование синтетических поверхностно-активных веществ и органических растворителей. Посуду сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной - в сушильном шкафу при + 105° С в течение 1 часа.
Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающими крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т.п.
13.2 Отбор, транспортировка, хранение и подготовка проб
13.2.1 Для исследования берутся репрезентативные торф и сапропель.
Гуминовые кислоты (ГК) выделяются 0.1 н раствором NaOH и нейтральным 0.1 М раствором Na4P2O7 (далее соответственно щелочные и пирофосфатные вытяжки ГК). Для щелочных и пирофосфатных вытяжек ГК контролем служит соответственно 0.1 н раствор NaOH и 0.1 М раствор Na4P2O7
Все последующие этапы оценки биологического активности экстрактов торфов и сапропелей желательно проводить в максимально сжатые сроки.
13.2.2 До проведения тестирования экстракт нагревают до температуры 20 ± 2° С. После чего отбирают определенный объем жидкости и проводят анализ.
13.2.3 Аналогичную процедуру проводят с жидкостью, которую используют в качестве контрольного раствора.
13.3 Подготовка тест – системы и прибора
13.3.1 Подготовка тест – системы
Забор крови для исследования производят стандартным способом [2, 3, 4]. Кровь смешивают с гепарином в пробирке в соотношении 9 : 1 (концентрация гепарина 50 ед. на 1 мл крови) в количестве достаточном для измерения не менее 20 проб. Для измерения 1 пробы необходимо 50 мкл крови. Содержание крови при температуре + 1 - 2 °С (в холодильной камере и (или) на тающем льду), позволяет сохранить параметры ОАЭ в течение 6 часов. Перед использованием кровь в пробирке оксигенируют путем перемешивания её стеклянной палочкой.
13.3.2 Способы и пути введения исследуемого и контрольного образца
Исследуемый образец. Экстракт с исследуемым объектом смешивают в чистой пластиковой пробирке стеклянной палочкой с пробой крови. Время с момента смешивания крови с экстрактом до начала измерений параметров ОАЭ составляет 10 минут. Выбор времени определялся минимальным временем, позволяющим проводить измерения без технических задержек.
Контрольный образец. В качестве контроля используют кровь того же животного к которой добавляют контрольную жидкость. Время с момента смешивания до начала измерений параметров ОАЭ составляет 10 минут.
13.3.3 Подготовка прибора
Подготовку приборов «Световой анализатор параметров обратимой агрегации эритроцитов»» проводят в соответствии с руководством по эксплуатации.
14.1 Определение степени биологической активности экстрактов торфов и сапропелей.
При определении степени биологической активности экстрактов торфов и сапропелей необходимо проводить параллельное измерение контрольных и опытных проб. Рекомендуется иметь не менее 10 (десяти) повторностей измерений каждой серии. Для получения большей достоверности результатов измерений число повторностей может быть увеличено. Последовательно измеряют не менее 10 (десяти) пар контроль – опыт.
В стандартном анализе отбирают в пробирку типа Эппендорф 45.0 микролитров стабилизированной гепарином крови лабораторных животных, добавляют исследуемый объект – экстракт торфов и сапропелей в количестве 5.0 микролитров. Смесь перемешивают стеклянной палочкой и через 10 минут измеряют значения параметров ОАЭ в опытной пробе.
14.1.1 Измерение значений параметров ОАЭ проводят согласно руководству по эксплуатации прибора. В стандартном варианте через 10 минут экспозиции при температуре 20 ± 2°С. При необходимости допустимо проведение анализа через другой интервал времени.
14.1.2 В стандартном анализе измерение значений параметров ОАЭ в контрольной пробе проводят аналогично п. 14.1 и п. 14.1.1 с тем отличием, что вместо экстракта торфов и сапропелей добавляют контрольную жидкость.
14.2 Определение степени активности исследуемого образца
Степень биологической активности (СБА) экстрактов торфов и сапропелей оценивают по изменению показателей ОАЭ под воздействием экстрактов торфов и сапропелей в контрольной и опытной пробах. Показатель СБА исследуемого объекта вычисляют в виде безразмерной величины:
СБА = 100 (Рк – Ро) / Рк,
где соответственно Рк и Ро – усредненные значения тест - параметров контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемых проб.
При отсутствии достоверных различий регистрируемых параметров ОАЭ в опыте и контроле вычисление СБА не производится.
15 Обработка, оценка и оформление результатов
15.1 Обработка результатов измерений
Обработку результатов измерений параметров ОАЭ производят путем расчета среднеарифметического значения величины соответствующего показателя по формуле:
Рn =(P1+P2+…Pn) / n,
где P1+P2+…Pn - повторности проб,
Рn - значение соответствующего тест - параметра
n – количество повторностей.
Величины P1+P2+…Pn получают не менее чем из 10 параллельных измерений (n ³ 10) контроль - опыт в короткий промежуток времени.
15.2 Оценка достоверности различий результатов измерений
Оценка достоверных различий результатов измерений регистрируемых показателей ОАЭ в контроле и опыте осуществляют по непараметрическому критерию Манна – Уитни [11]. С целью нивелирования индивидуальных различий исследуемых показателей, показатели, измеренные в контроле, принимают за 1.
15.3 Оформление результатов измерений
Результат определения степени биологического активности исследуемого образца представляют в виде протокола (Приложение 1).
16 Контроль погрешности методики оценки биологического активности
16.1 Контроль качества оценки биологического активности проводят по определению чувствительности тест - реакции (параметров обратимой агрегации эритроцитов) к модельному "эталонному" токсиканту. Установление метрологических характеристик погрешности методики биотестирования в лабораторных условиях производится в соответствии с [8].
Регулярно проводимая проверка позволяет выявить ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые в условиях проведения опытов.
16.2 Процедура оценки погрешности методики. Исследования проводят с использованием двухромовокислого калия K2Cr2О7 в качестве стандартного токсиканта [12]. С этой целью на дистиллированной воде готовят маточный раствор K2Cr2O7 в концентрации 1 ± 0,01 мг/см3. Навеску 0,1 г K2Cr2O7 помещают в мерную колбу на 100 см3 и растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, тщательно перемешивают и доводят до метки. Затем готовят рабочий раствор модельного токсиканта 0,1±0,002 мг/см3 разведением дистиллированной водой основного раствора в 10 раз.
16.2.1 В стандартном анализе отбирают в пробирку типа Эппендорф 45.0 микролитров стабилизированной гепарином крови лабораторных животных, добавляют исследуемый объект – рабочий раствор модельного токсиканта в количестве 5.0 микролитров. Смесь перемешивают стеклянной палочкой и через 10 минут измеряют значения показателей ОАЭ в опытной пробе. Измерение значений параметров ОАЭ в контрольной пробе проводят аналогично п. 14.1.2.
16.3 Должно происходить достоверное изменение хотя бы одного из регистрируемых показателей ОАЭ по сравнению с контролем. В случае если достоверных изменений регистрируемых параметров ОАЭ по сравнению с контролем не наблюдается, то следует проверить точность приготовления исследуемых растворов или условий проведения опытов.
17 Форма представления результатов анализа
Приложение 1
Форма регистрации условий и результатов биотестирования
ПРОТОКОЛ №_ определения степени биологического активности экстрактов торфов и сапропелей с использованием агрегатов эритроцитов крови лабораторных животных (таблица 1)
Таблица 1
| № п.п. | Параметр | Значение |
| 1. | Наименование организации: | |
| 2. | Наименование пробы и место отбора | |
| 3. | Метереологические условия: (температура и влажность воздуха, направление и сила ветра, атмосферное давление) | |
| 4. | Дата, время отбора пробы: | |
| 5. | Условия отбора и транспортировки пробы: | |
| 6. | Дата измерения проб: | |
| 7. | Число повторностей измерения проб: | |
| 8. | Условия проведения анализа: | |
| 9. | Результаты биотестирования: (таблица 2) | |
| 10. | Усредненный индекс биологической активности: | |
| 11. | Погрешность измерения: | |
| 12. | Оператор, Ф.И.О.: |
Результаты измерений показателей ОАЭ (таблица 2).