Спочатку лімфоцит і клітку-мішень вступають у тісний контакт і утворять так називанийкон’югат. Потім кілерна клітка робить на клітку-мішень деякий вплив, що ушкоджує її так, що згодом вона гине; необхідною умовою є присутність у середовищі іонів кальцію. Загибель цієї клітки-мішені відбувається навіть у тому випадку, якщо кон’югат розпадається і кілерний лімфоцит прикріплюється до іншої клітки. Створюється враження, що кілерна клітка пускає в хід якусь програму – визначений ланцюжок подій, що неминуче завершується загибеллю клітки-мішені.
Хенні і Марц одними з перших припустили, що лімфоцит убиває свою жертву, ушкоджуючи її плазматичну (зовнішню) мембрану Підставою до цього послужило те спостереження, що радіоактивні молекули, введені в клітку-мішень як маркери, швидко її залишають після того, як клітку ушкоджує лімфоцит При цьому мембрана ушкодженої клітки стає проникною тільки для маркерів не крупніше визначеного розміру; можна було думати, що мембрана не просто рветься, а в ній виникають дірки чи пори.
Ця гіпотеза знайшла реальний ґрунт у 1980 м Р. Дурмашкін, П. Хенкарт із Національного інституту раку та їх колеги досліджували поверхню ушкодженої клітки-мішені за допомогою електронного мікроскопа при великому збільшенні і знайшли кільцеподібні структури, які можна було інтерпретувати як дірки в мембрані Через три роки їхнє відкриття підтвердили Э. Подак з Нью-йоркського медичного коледжу і Г. Деннерт із Медичної школи Університету Південної Каліфорнії, що вивчали дію культивуючих кілерних кліток на пухлинні клітки. Вони установили, що поверхня клітки-мішені поцяткована дірками з внутрішнім діаметром від 5 до 20 нм.
Залишалося, однак, зовсім неясним, чи утворяться пори саме під дією чи лімфоцита ж їхнє виникнення просте відбиває останню стадію загибелі клітки, що викликається зовсім іншим ушкодженням. Пошуки відповіді на це питання довгий час утрудняла відсутність надійного джерела кілерних кліток Але в 1977 р. С. Джилліс з Immunex Corporation, К. Сміт з Дартмутської медичної школи і група Р. Галло в Національному інституті раку знайшли умови для підтримки в культурі мишачих лімфоцитів – як цитотоксичнихТ-кліток, так і Мк-кліток. Це удалося завдяки тому, що були ідентифіковані живильні речовини і фактори росту, необхідні для існування таких кліток у культурі. Одним із ключових факторів виявився лімфокін, називаний інтерлейкіном-2 Тепер можна було вирощувати клони лімфоцитів, отримані з кліток з відомими властивостями, що дало в руки дослідників невичерпне джерело гомогенних культур цитотоксичнихТ-кліток і Мк-кліток і тим самим розчистило шлях для детального аналізу цих кліток методами клітинної біології і біохімії.
Одне з властивостей кілерних лімфоцитів відразу ж привернуло увагу дослідників. За допомогою електронної мікроскопії в цитоплазмі цих кліток виявлялася безліч дрібних темних органелл (внутрішньоклітинних елементів) на зразок гранул, що запасають, характерних для секреторних кліток. Звичайно в таких гранулах накопичуються речовини, що повинні надходити в навколишнє середовище в потрібний момент відразу у великій кількості. Це відбувається шляхом екзоцитозу: гранули рухаються до поверхні клітки, зливаються з її плазматичною мембраною, і їхній вміст виливається назовні.
Трохи дослідників спостерігали, що, коли кілерний лімфоцит приступає до знищення клітки-мішені, гранули концентруються в тій його частині, що ближче до місця контакту з мішенню. А. Купфер і С. Сінгер з Каліфорнійського університету в Сан-Дієго, а також Деннерт показали, що апарат Гольджі, у якому формуються гранули, теж направляється до місця контакту В орієнтації апаратаГольджі і гранул, очевидно, бере участь цитоскелет (внутрішня волокниста мережа) кілерної клітки. Ті ж дослідники показали, що незабаром після встановлення контакту з кліткою-мішенню цитоскелетні структури кіллерної клітки певним чином перегрупуються.
Переорієнтація цитоскелету і рух стопок апаратаГольджі і гранул відбувається тільки після зв'язування лімфоцита з мішенню. Р. Тсен з Каліфорнійського університету в Берклі показав, що зв'язування викликає швидке і значне збільшення концентрації іонів кальцію усередині лімфоцита; це у свою чергу активує екзоцитоз. Дж. Янеллі й У. Енгельгард з Віргінського університету вдалося провести мікрокінозйомку переорієнтації гранул у цитоплазмі і їхнього злиття з плазматичною мембраною.
Усі ці дані дозволили думати, що у відповідь на контакт із кліткою-мішенню секреторний апарат кілерної клітки направляється на жертву і летального агента, що міститься в гранулах, «вистрілюється» у неї. Щоб перевірити цю гіпотезу, необхідно було довести, що гранули дійсно виконують ту ж функцію, що і зарядні шухляди в артилерії, а потім з'ясувати, що ж являють собою самі снаряди.
Першою задачею було виділити гранули і подивитися, чи можуть вони самі по собі убивати клітки. Це було зроблено в 1984 р. Хенкартом і Подаком і незалежно нашою групою. Ми застосовували різні методи фракціонування внутрішньоклітинних структур. У результаті таких експериментів вдається, зруйнувавши клітку на складові частини, визначити, у якій з них міститься той чи інший фермент чи зосереджена та чи інша функція. Кілерні лімфоцити піддавали впливу азоту під високим тиском, що приводило до їх руйнування. Суспензію зруйнованих кліток наносили на градієнт щільності, створений інертними частками, і потім обертали у високошвидкісній центрифузі. Під дією відцентрової сили різніорганелли переміщалися до дна пробірки і, потрапляючи в область із щільністю, рівноїсвоїй власній, зупинялися. У результаті всіорганелли розподілялися уздовж центрифужної пробірки у виді дискретних смуг. Кожну фракцію градієнта потім досліджували за допомогою електронного мікроскопа, визначали її ферментативну активність і здатність убивати клітки.
Одна з фракцій за даними електронної мікроскопії складалася майже винятково з гранул, містилавизначений набір ферментів і, головне, могла убивати клітки: коли ізольовані гранули змішували з еритроцитами чи пухлинними клітками в середовищі, що містить іони кальцію, клітки гинули через кілька хвилин. На електронних мікрофотографіях було видно, що поверхня цих кліток містила кільцеподібні структури, не відмінні від тих, котрі формуються в мембрані клітки-мішені під дією живих кілерних кліток. У такий спосіб ми показали, що гранули кілерних кліток дійсно містять той летальний агент, за допомогою якого ці клітки убивають.
Незабаром був ідентифікований сам цей агент. У 1985 р. у співробітництві зПодаком і Г. Хенгартнером з лікарні Цюрихського університету ми знайшли білок, що у присутності іонів кальцію викликала такі ж ушкодження клітинної мембрани, як і живікілерні клітки чи виділені з них гранули. Цей білок ми одержали в чистому виді, пропустивши екстракт гранул через хроматографічністовпчики (де білки розділялися в залежності від електричного заряду і молекулярної маси) і перевіривши кожну фракцію на здатність викликати лізис еритроцитів, тобто ушкодження зовнішньої мембрани, у результаті якого клітки набухають і лопаються. Незалежно білок-«убивцю» виділили Д. Мессоні і Ю. Чопп з Університету в Лозанні. За здатність утворювати пори він названий перфоріном.
До цього часу в гранулах цитотоксичнихТ-лімфоцитів і NK-кліток виявлений тільки одинутворюючий пори білок – цей самий перфорін. Його молекулярна маса 70 тис. дальтонів. Якщо клітки інкубують з перфоріном у присутності іонів кальцію, вони через кілька хвилин лізуються. Однак якщо іони кальцію додати до перфоріну до того, як він зв'яжеться з клітками, то білок зовсім не виявляє своюлізуючуздатність. Цей парадоксальний на перший погляд факт багато чого проясняє в механізмі дії перфоріна на клітки.
Кілерна клітка виділяє молекули перфоріна, і ці молекули вбудовуються в мембрану клітки-мішені. Там вони полімеризуються, тобто з'єднуються один з одним. Полімеризація відбувається тільки в присутності іонів кальцію. Полімер, що утвориться, може приймати різні конфігурації, але в оптимальних умовах кінцевий продукт полімеризації має форму циліндра. При електронній мікроскопії він виглядає як кільце, якщо орієнтований уздовж пучка електронів, і як дві рівнобіжних лінії – якщо поперек. Внутрішній діаметр циліндра, за даними Подака і Деннерта, варіює від 5 до 20 нм.
Щоб перфорінзашкодив клітку-мішень, його полімеризація повинна відбуватися усередині мембрани, тому що впровадитися в мембрану можуть тільки мономери перфоріну. Якщо полімеризація відбудеться в розчині, то полімер не зможе проникнути потім у мембрану й убити клітку. Зміст цього зрозумілий: виявившись у позаклітинному просторі чи кровотоці, де в надлишку мається кальцій, перфорін швидко полімеризуеться і стає неактивним, що виключає можливість випадкового ушкодження інших, нормальних кліток організму.
Утворення в клітинній мембрані пір у результаті полімеризації перфоріну приводить до швидкого і легко помітного стану клітки. Зовнішня мембрана живої клітки утримує усередині її білки й інші великі молекули (за винятком тих, котрі повинні секретуватись). Крім того, вона забезпечує поділ іонів, так що одні з них концентруються усередині клітки, а інші залишаються ззовні. Унаслідок нерівномірного розподілу позитивно і негативно заряджених іонів існує мембранний електричний потенціал: внутрішній вміст клітки має негативний заряд стосовно позаклітинного середовища. Коли цілісність мембрани порушується, іони і вода перерозподіляються у відповідності зі своїми електрохімічними градієнтами, прагнучи до рівноваги, і мембранний потенціал зникає. Якщо дірки невеликі по розмірах, то виникає так називаний ефект Доннана: великі молекули не можуть вийти з клітки, тому що дірки для них малі, а вода і солі з навколишнього розчину проникають через мембрану усередину. В результаті клітка набухає і зрештою лопається.
За допомогою введених у клітку-мішень мікроелектродів нам вдалося зареєструвати значне падіння мембранного потенціалу незабаром після додавання перфоріну. Чуттєве електронне устаткування дозволило навіть вимірити потік іонів, що проходить через індивідуальну пору. Отримані результати погоджувалися з пророкуваннями теорії ефекту Доннана. Наші дані, крім того, свідчили, що утвореніперфоріном пори – це стабільні структури і внутрішній канал пори постійно відкритий. Встановивши, які іони і молекули проходять через ушкоджену перфоріном мембрану, ми оцінили внутрішній діаметр пори. Він виявився в межах 1 – 10 нм, що трохи менше, ніж випливало з електронних мікрофотографій (5 – 20 нм).