Зависящие от времени процессы в ядерном магнитном резонансе (стр. 2 из 4)

Так как константы взаимодействия J, как правило, не коррелируют с разностью химических сдвигов, то в ряде случаев на основе этих констант должна быть установлена шкала времени, отличная от шкалы химических сдвигов. При наличии в спиновой системе взаимодействия, например косвенного спин-спинового, химический обмен не поддается описанию с помощью простых уравнений Мак-Коннела. Однако принципиально возможно описание поведения такой системы с привлечением квантово-механических подходов.

Какую биохимическую информацию можно извлечь из изучения процессов, связанных с химическим обменом? В области быстрого обмена в принципе можно рассчитать населенности отдельных состояний при условии наличия некоторой дополнительной информации. При этом наиболее важной является информация о числе состояний, участвующих в быстром обмене, так как это число присутствует в расчетной формуле в качестве параметра.

Для описания быстрого обмена между Nсостояниями следует обобщить уравнение на случай Nсостояний:

с учетом того, что в уравнении необходимо экспериментально определить значения <5и в случае, когда населенность второго партнера будет существенно большей. В общем случае в расчет следует включить еще сведения о функциональной зависимости. Если найдено, что в реальном случае спектр ЯМР позволяет наблюдать случай быстрого обмена, то отсюда непосредственно следует, что время корреляции процесса обмена X_eменьше чем 1/1 Ад I.

В случае медленного обмена спектр будет более информативным. Наименьшее число различных состояний можно вычислить из числа резонансных линий, а соответствующие значения населенностей можно непосредственно получить из величины интеграла для каждой резонансной линии. Это позволяет зафиксировать с помощью ЯМР различные состояния, которые ранее удавалось зафиксировать только косвенно, например, с привлечением кинетических методов. Кроме того, здесь можно получить ограничение на значение времени корреляции обмена X_e: это значение должно быть больше чем 1 / I Д ьI. В промежуточной области вблизи

– 1 обмен вызывает существенные изменения формы линии. Это позволяет путем построения теоретического спектра достаточно точно определять значения времени корреляции обменных процессов T_x в различных состояниях X. В области умеренно медленного обмена между экспериментально наблюдаемыми значениями времени поперечной релаксации Тц1, времени релаксации T_ixв отсутствие обмена вместе с уравнением дает модифицированное уравнение Хендерсона-Хассельбалха

Если измерить зависимость химического сдвига от рН и описать эту зависимость с помощью уравнения, подбирая рК, то непосредственно из ЯМР-экспериментов удается получить значения р / С для индивидуальных групп. Это особенно важно, если речь идет, например, о спектрах ¹Hпротеинов, поскольку данный метод достаточно точно позволяет определить значения рК каждого заряженного остатка.

Неорганический фосфат принимает участие во многих ферментативных реакциях, поскольку он либо переносится на субстрат, либо расщепляется. Кроме того, неорганический фосфат принимает на себя функцию буфера. Для фосфатной группы существуют кроме двух различных протонированных форм в равновесии еще и следующие формы: Н3РО4, H₂PO₄», HPO₄²», PO₄³». При измерении спектров ЯМР ¹P для различных значений рН мы всякий раз наблюдаем один сигнал, химический сдвиг которого изменяется в зависимости от концентрации ионов гидроксония. Такой вид спектра полностью соответствует случаю быстрого обмена.

Если по одной из осей отложить значение химического сдвига, а по другой рН, то можно построить кривую титрования, состоящую из четырех интервалов. Отсюда следует, что вещество, участвующее в данном процессе быстрого обмена, существует по крайней мере в четырех различных формах, которые характеризуются значениями химических сдвигов O_i, д₂,O₃и д₄, что полностью соответствует предположениям о четырех состояниях протонирования неорганического фосфата, полученным из химического подхода.

В данном случае функциональная зависимость является несколько более сложной, чем описываемая уравнением, так как здесь для описания равновесия необходимо использовать более одного значения рК. Используя закон действующих масс, можно расширить уравнение на Nзначений pKjЕсли кооперативные эффекты отсутствуют, то для Nзначений рК; можно просто записать сумму

Если значениясK₁существенно отличаются друг от друга, как это имеет место на рис. 2.8, то вблизи каждого из значенийсK_iможно достаточно точно построить значения химических сдвигов, используя простое уравнение. Этот метод применяется достаточно часто, если необходимо построить какой-либо из участков кривой титрования.

4. Образование комплексов с диамагнитными лигандами

Комплексообразование молекул с диамагнитными лигандами подчиняется тем же правилам, что и процесс протонирования, зависящий от значения рН. Однако скорости обмена часто настолько малы, что условие быстрого обмена не выполняется. Интересными с точки зрения биологических приложений являются комплексы с ионами металлов, которые играют роль катализаторов в большинстве ферментативных превращений. Особенно часто встречаются комплексы двухвалентных металлов таких, как магний и кальций. Основным веществом в биологических реакциях является адено-зин‑5‑трифосфат, образующий в физиологических условиях комплекс с ионом Mg.

Устойчивость Mg.ATO-KOMiDieKcaзависит от температуры. В больших магнитных полях переход от медленного к быстрому обмену происходит примерно при 25°С. При низких температурах можно отдельно наблюдать сигналы от Mg.ATO и свободного АТФ. При повышении температуры наблюдается усредненная резонансная линия, положение которой зависит от концентрации реагентов.

Анализ формы линии позволяет достаточно точно найти значение скорости обмена и энергии активации, которые определяются используемой буферной системой. В отличие от этого комплекса время жизни комплекса с кальцием настолько мало, что при самых сильных магнитных полях выше точки замерзания воды реализуется случай почти быстрого обмена.

Таблица 2.5. Значения энергий активации и скоростей обмена в комплексе М.АТФ

Скорость обмена k_ j -1 /Tf_iи энергии активации ДCj^ сильно зависят от значения рН раствора и от типа ионов, содержащихся в этом растворе. Приведенные в табл. значения вычислены из спектров, показанных на рис. 2.9.

Во многих реакциях ферментативного превращения Mg‑БФЦ сам является субстратом, поэтому ферментативная активность, прежде всего, определяется концентрацией свободного Mg.ATO. Это значение концентрации можно непосредственно определить по спектрам ЯМР из интенсивности соответствующих резонансных линий при понижении температуры. При более высоких температурах можно косвенно судить о концентрациях по химическому сдвигу, если известна константа связывания АТФ с магнием в данных экспериментальных условиях.

5. Перенос поляризации с насыщением

В области медленного обмена используется метод, основанный на переносе поляризации с насыщением. С помощью этого метода часто удается провести более точное и однозначное определение времен корреляции обменных процессов по сравнению с данными, получаемыми из анализа формы линии. Кроме того, метод переноса поляризации с насыщением позволяет получить дополнительную информацию о том, действительно ли две наблюдаемые в спектре резонансные линии соответствуют двум состояниям, между которыми осуществляется обмен. Реализация этого метода достаточно проста. С помощью импульса длительностьюф,воздействующего селективно, т.е. на определенной частоте, проводится насыщение линии В и измерение обычного спектра ЯМР. Этот эксперимент является примером использования метода селективного насыщения для подавления пика растворителя.

Пусть в момент временифположение спина, резонансная линия которого подлежит насыщению, изменится и осуществится переход из положения В в положение А. В этом случае интенсивность резонансной линии, соответствующей положению А, уменьшится. Эффективность этого метода, с одной стороны, определяется длительностью интервалаф,в течение которого осуществляется обмен, и скоростью обмена в системе 1/ Х_А. С другой стороны, эффект уменьшается по мере установления равновесного распределения Больцмана, которое характеризуется временем продольной релаксации T_iА. Формально интенсивность I_aрезонансной линии А в зависимости от времени ф,в течение которого проводится насыщение резонансной линии В, описывается следующим выражением:

Для времени насыщения при условии, что оно существенно больше значения Т_}А, устанавливается состояние равновесия и отношение интенсивностей линий при наличии или отсутствии насыщения дается формулой