Зависящие от времени процессы в ядерном магнитном резонансе (стр. 4 из 4)

Типичным примером такого рода замещения является замена ¹⁴N на ¹⁵N, ¹²C на ¹³C и ¹H на ²H. Это изотопное замещение наиболее интересно при проведении исследований методом ЯМР in-vivo. Трудности возникают только для ядер ³¹P, для которых отсутствуют стабильные изотопы, при использовании которых можно было бы провести изотопное замещение обычными методами. Здесь ситуацию можно существенно упростить, проведя маркировку по всей группе. Можно проследить за поведением фосфатной группы в процессе реакции, если провести маркировку по изотопам кислорода ¹⁷O или ¹⁸O, естественное содержание которых весьма невелико.

Проведение изотопного замещения по ¹⁷O, спин которого равен 5/2, приводит к расщеплению сигнала фосфора в секстет. Наличие квадрупольного момента у кислорода уменьшает время релаксации ядерного спина ⁷O. Спин-спиновое взаимодействие с ядром ³¹P позволяет получить представление об эффективных механизмах, дающих дополнительный вклад в релаксацию. Если с атомом фосфора связаны больше одного атома ¹⁷O, то линия приобретает сложную мультиплетную структуру, так что интенсивность сигнала уменьшается, и его уже трудно отличить от фона. Иная картина наблюдается для изотопа ¹⁸O. Этот изотоп, как и изотоп ¹⁶O, наиболее распространенный в природе, обладает нулевым спином и не вызывает появления дополнительной структуры в наблюдаемой спектральной линии. Правда, замена атома ¹⁶O в фосфатной группе на атом О приводит к небольшому высокопольному сдвигу резонансной линии на 0,025 м.д., причем этот сдвиг пропорционален числу связанных с атомом фосфора тяжелых изотопов. При этом можно наблюдать сигнал ЯМР ³¹P от фосфатной группы отдельно, что позволяет установить число атомов ¹ О.

Изотопный обмен ¹⁸O может быть использован для более полного изучения реакций ферментативных превращений. При катализе большая группа ферментов расщепляет фосфаты, ответственные за энергозапас, и таким образом осуществляется перенос фосфатной группы или на другой субстрат или на окружающую воду. При ферментативном гидролизе нуклеозидтрифосфата, ответственного за энергозапас клетки, в качестве промежуточного продукта возникает такое состояние фосфатной группы, при котором связь с ангидридом фосфорной кислоты уже расщеплена, однако фосфатный остаток P₁ – еще связан с нукле-озиддифосфатом и присоединен к ферменту Е. Формально эту реакцию можно представить в виде следующего уравнения:

В принципе, все этапы реакции в являются обратимыми, хотя скорость протекания этих процессов зависит от активационной энтальпии ДG*^, т.е. от особенностей ферментативного катализа. Для многих ферментов этап повторяется многократно, прежде чем, наконец, фосфатная группа попадет в воду. Если провести полное замещение по концевой фосфатной группе в НТФ по изотопу ¹⁸O, то при протекании реакции в обычной воде всякий раз при прохождении первого этапа реакции атом¹⁶O встраивается в фосфатную группу. Если же обратный процесс невозможен до тех пор, пока в реакционную смесь не попадет Pi, то в смеси присутствует только вещество следующего состава: Р¹⁶0¹⁸0з. В другом предельном случае, т.е. при условии, что первый этап реакции будет многократно повторяться, прежде чем в реакционную смесь попадет Pi, в смеси можно обнаружить свободный P¹⁶и4· Использование соответствующих теоретических моделей позволяет найти зависящее от времени распределение меток. Согласование свободных параметров дает возможность предположить, что существует конечное число обратных реакций с высвобождением Piи значением константы скорости к-г для связывания Piв комплекс Е.НДФ. На рис. 2.13 приведен пример такого моделирования для миозинового фрагмента Si. Правда, здесь проведено рассмотрение не для меченой АТФ, а для изотопомеченого неорганического фосфата. Здесь наблюдается обратная реакция в присутствии комплекса Sl. Mg.AДΦ. В этой системе первый этап повторяется примерно 40 раз, прежде чем высвобождается фосфат. Первые эксперименты по изучению механизма ферментативного изотопного обмена в фосфатной группе проходили с привлечением масс-спектрометрии, поскольку этот метод является весьма чувствительным для определения изотопного состава в малых молекулах. Преимуществом ЯМР является то, что при определении изотопного состава можно проводить измерения непрерывно, без дериватизации, хотя при работе с низкими концентрациями метод масс-спектрометрии, конечно, более эффективен.