Разработка методики мониторинга эколого-функционального состояния почвогрунтов (стр. 7 из 18)
1) разработка методов контроля наиболее уязвимых свойств почв, изменение которых может вызвать потерю плодородия, ухудшение качества растительной и животной продукции, деградацию почвенного покрова;
2) постоянный контроль важнейших показателей почвенного плодородия;
3) ранняя диагностика негативных изменений почвенных свойств;
4) разработка методов контроля сезонной динамики почвенных процессов, изменением свойств почв при длительных антропогенных нагрузках.
Среди наиболее уязвимых свойств почв и особо опасных процессов, которые проявляются во всех почвах любых природных зон, - потеря гумуса и изменение его качественного состава, увеличение кислотности или щелочности, изменения состава обменных катионов, загрязнение почв пестицидами, детергентами и другими органическими соединениями, угнетение почвенной биоты.
Невозможно организовать в целях экологического мониторинга эффективные наблюдения, не учитывая взаимосвязь и постоянное взаимодействие природных компонентов, изменение структурно-функциональных характеристик их отдельных звеньев при поступлении ксенобиотиков, которые вызывают изменение других звеньев, функционально с ними связанных. Поэтому выбор чувствительных к антропогенному воздействию показателей состояния экосистемы может меняться в зависимости от задач исследования. Однако, на любом уровне – микроскопическом, локальном или глобальном в ходе почвенно-экологического мониторинга особого внимания заслуживают методы исследования процессов образования и перераспределения в почвах химических веществ.[24]
3.3 Исследование ферментативной активности почвы
Как уже говорилось выше, при проведении мониторинга и диагностики состояния почв, в первую очередь, следует определять биохимические показатели: рекомендуются показатели изменения ферментативной активности. Определение ферментативной активности основано на учете количества переработанного в процессе реакции субстрата или образующегося продукта реакции в оптимальных условиях температуры, рН среды, концентрации субстратов, величины навески почвы, времени инкубации. Для количественного определения конечных продуктов реакции применяются различные химические, фотометрические, колометрические, и другие методы. Для качественных измерений наличия ферментов в почве широко используются хроматографические методы.
Сущность методов определения активности ферментов почвы заключается в следующем: навеску почвы насыщают антисептиком, добавляют буферный раствор с рН, оптимальным для данного фермента, и определенное количество субстрата. Реакционную смесь в основном при температуре 30 - 370С выдерживают в термостате в течение определенного времени при периодическом перемешивании и после этого проводят количественный учёт или качественную идентификацию продуктов реакции. Активность фермента выражают в количествах переработанного субстрата или образующегося продукта реакции в течение определенного промежутка времени и рассчитывают на единицу веса почвы или гумуса. Такие условия позволяют определить максимальную потенциальную ферментативную активность почвы. [25]
Таким образом, определив активность некоторого комплекса ферментов (табл.5) можно судить об эколого-функциональном состоянии почвы, а исследовав период восстановления ферментативной активности можно судить о последствиях воздействия загрязняющих веществ на почву (табл.6). Подробно методы определения ферментативной активности будут описаны ниже.
Таблица 5
Шкала сравнительной оценки ферментативной активности почвы[26]
| Активность | Каталаза, см3 О2 на г за 1 мин | Дегидрогеназа, мг ТФФ на 10 г за 24 ч | Фосфатаза, мг Р2О5 на 10 г за 24 ч | Уреаза , мг NН3 на 10 г за 24 ч | Протеаза, мг альбумина на 10 г за 24 ч | Инвертаза, мг глюкозы на 1 г за 24 ч |
| Очень слабая | <1 | 0-3 | >0,5 | >3 | 0-0,5 | >5 |
| Слабая | 1-3 | 3-7 | 0,5-1,5 | 3-10 | 0,5-1,0 | 5-15 |
| Средняя | 3-10 | 7-15 | 1,5-5,0 | 10-30 | 1-2 | 15-50 |
| Высокая | 10-30 | 15-22 | 5-15 | 30-100 | 2-3 | 50-150 |
| Очень высокая | >30 | >22 | >15 | >100 | >3 | >150 |
Таблица 6
Оценка воздействия загрязняющих веществ на почву[26]
| Период восстановления ферментативной активности, дни | Оценка последствий | |
| Лабораторные условия | Полевые условия | |
| 15 | 30 | Не оказывает влияния |
| 15 – 30 | 30 – 60 | Незначительное влияние, но возможны отрицательные последствия |
| >30 | >60 | Существенное влияние, возможны серьезные экологические последствия |
Глава 4. Материалы и методы
4.1 Основные требования, предъявляемые к методам определения активности ферментов в почве
Почва является сложной гетерогенной системой, в которой большинство биохимических реакций происходят на интерфазе жидкого, твердого и газообразных компонентов. Это создает много методологических проблем при изучении почвенных ферментов. Главная методологическая трудность заключается в необходимости отделения внутриклеточной активности функционально активных микроорганизмов от изучаемой внеклеточной ферментативной активности почвы. Другая трудность заключается в том, что так как почва является сильным адсорбентом, некоторые субстраты и продукты их ферментативной реакции могут сорбироваться почвенными компонентами. Это приводит к искажению результатов их количественного измерения. Поэтому в каждом конкретном случае необходимо это принимать во внимание при выборе субстрата и экстрагентов продуктов реакции.[25]
Активность ферментов максимальна в верхних наиболее биогенных почвенных горизонтах и вниз по почвенному профилю падает, что связано с уменьшением запасов органического вещества, меньшим количеством животных, микроорганизмов, корней растений в нижних горизонтах.[27]
Инактивация деятельности микроорганизмов в почвенных пробах. Ферметативную активность почвы определяют в присутствии почвенных микроорганизмов в реакционной среде. Современные методы почвенной энзимологии дают общую характеристику активности почвенных ферментов, присутствующих в почве вне клеток живых организмов (свободные внеклеточные ферменты и внутриклеточные ферменты, связанные с фрагментами разрушающихся мёртвых клеток микроорганизмов и тканей растений), и ферментов, которые могут выделяться живыми микроорганизмами в процессе определения ферментативной активности почвы в результате неполного ингибирования. Отсюда вытекает главная методологическая проблема почвенной энзимологии: провести эффективную инактивацию роста и физиологических процессов микроорганизмов в почвенной пробе, чтобы предотвратить выделение новых ферментов и в то же время оставить почвенные ферменты неизменёнными и не нарушить химические и физические свойства почвы, что может привести к изменению их активности.
Основное требование к инактиваторам: они не должны разрушать клетки микроорганизмов (плазмолиз) и изменять проницаемость клеточных оболочек для ферментов, субстрата и продуктов реакции. Эффективная инактивация жизнедеятельности микроорганизмов предотвращает поступление в почву дополнительных количеств ферментов, утилизацию субстрата и продуктов реакции микроорганизмами, которые могут значительно исказить истинные значения показателей ферментативной активности исследуемой почвы.
Определение ферментативной активности может дать надёжный результат только в том случае, если концентрация субстрата не снижается в результате обстоятельств, не связанных с ферментативным превращением его, и если концентрация продуктов, образующихся из субстрата под воздействием ферментов, не изменяется вследствие процессов, не связанных с исследуемой ферментативной реакцией (адсорбция, связывание другими соединениями почвы).
На скорость ферментативной реакции влияет множество факторов. К ним относятся температура инкубации, концентрация водородных ионов, состав применяемых буферных растворов, концентрация субстрата, величина навески почвы, наличие различных активаторов и ингибиторов и т. д. При разработке почвенно – энзимологических методов определяют оптимальные значения этих констант, которые для разных групп и даже отдельных ферментов различны.
Навеска почвы и концентрация субстрата. Измерение активности ферментов в почве производят в определенных количествах почвенной пробы. С увеличением навески почвы скорость ферментативной реакции линейно возрастает (рис. 2)
Рис.2. Влияние количества почвы на скорость ферментативной реакции
Концентрацию субстрата выбирают с таким расчетом, чтобы скорость ферментативной реакции была постоянной в течение всего периода экспозиции и количество молекул субстрата хватило для насыщения всех молекул ферментов, содержащихся в данной навеске почвы, до конца реакции. Для этого требуют некоторый избыток субстрата. Однако большой избыток субстрата снижает скорость реакции.
Оптимальная концентрация субстрата устанавливается опытным путем для определенных величин навески почвы. Иногда произвольно берут разные навески почвы и концентрации субстратов, что является недопустимым. Для получения сопоставимых данных условия должны быть стандартизированы. В первую очередь необходимо установить минимальную величину навески почвы, в которой с достаточной точностью можно обнаружить активность изучаемого фермента, и соответственно этой навеске определить оптимальную величину концентрации субстрата.