работа студентки 2-го курса (стр. 2 из 6)

Для поиска в белковых последовательностях мотивов «спираль-поворот-спираль» (helix-turn-helix, HTH) использовалась программа “Helix-Turn-Helix Motif Prediction” (Dodd and Egan, 1990).

Результаты и обсуждение

Поиск ортологов белка-регулятора в геномах архей

В качестве первого этапа поиска ортологов был произведен поиск гомологов белка-регулятора из M. thermoautotrophicus в белковой базе данных при помощи программы BLAST. После этого уже среди геномов архей, имеющих гомолога, был проведен поиск ортологов данного регулятора, в результате был выбран ряд геномов (см. материалы и методы). Поиск ортологов белка-регулятора является необходимым условием изучения регуляции, поскольку при его отсутствии невозможно предположить, что искомые сайты в исследуемых геномах будут похожи на уже известные сайты в геноме M. thermoautotrophicus. Отсутствие ортолога белка-регулятора говорит о том, что-либо используется другой механизм регуляции, либо отсутствует данный метаболический путь. Отдельного внимания заслуживает ситуация с геномом M.barkeri. В настоящее время нам доступна лишь неполная последовательность генома этого организма, в которой не удалось найти ортолога белка-регулятора. Однако в белковой базе данных с помощью программы BLAST был найден гомолог регулятора из Methanobacter thermoautotrophicus. Поиск гомологов в геноме M. thermoautotrophicus показал, что лучшим гомологом для найденного белка из M. barkeri является именно регулятор MTH1654. Таким образом, эти два белка являются ортологами. Кроме того, нами были найдены ортологи MTH1654 в геномах двух других организмов из рода Methanosarcina: M. acetivorans и M. mazei. На основании этого мы исследовали регуляцию синтеза триптофана также и в геноме M. barkeri.

Выравнивание аминокислотных последовательностей белков-регуляторов показано на рисунке 2. Ранее были высказаны предположения о том, что данный белок содержат HTH-домен (Gelfand, 2000). Их картирование при помощи программы поиска HTH-доменов (Dodd and Egan, 1990) показало, что таковые имеются во всех белках. Несмотря на то, что данные участки выравниваются между собой, степень их сходства крайне низка, в результате чего возможны изменения в структуре регуляторного сигнал. Выравнивание показало также, что у белков-регуляторов из M. burtonii, P. furiosus, M. thermoautotrophicus и H. salinarum неправильно определены старты генов (Рис. 2).

На основе множественного выравнивания было построено филогенетическое дерево белков-регуляторов (Рис.3). Как видно из рисунка 3, степень сходства регуляторов низка, а, следовательно, и сигнал во всех изучаемых видах мог измениться в ходе эволюции. Поэтому для поиска сигнала разумно выделить на дереве группы, в которых регуляторы имеют достаточно высокий уровень сходства. Можно рассчитывать, что внутри таких групп сигнал скорее всего будет сохраняться. Поиск сигнала производился отдельно внутри каждой группы. Были выделены следующие группы:

- группа, соответствующая роду Pyrococcus;

- группа, включающая в себя рода Methanosarcina и Methanococcoides;

- группа, объединяющая рода Thermoplasma и Ferroplasma.

Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей белков-регуляторов с картированными на нем HTH-доменами (показаны белыми буквами на черным фоне). Обозначения: PAB - Pyrococcus abyssi, PH - Pyrococcus horikoshii, PF - Pyrococcus furiosus, MA - Methanosarcina acetivorans, MM - Methanosarcina mazei, MBA - Methanosarcina barkeri, MCB - Methanococcoides burtonii, AF - Archaeoglobus fulgidus, Hsp - Halobacterium salinum NRC-1, FAC - Ferroplasma acidarmanus, TA - Thermoplasma acidophilum, TVN - Thermoplasma volcanium, MTH - Methanobacter thermoautotrophicus.

PAB -------------------------------------MWGRIEHYFDEYPVRKLIAKTLL

PH -------------------------------------MWGRIEHYFDEYPVRKLIAKTLL

PF ----------------------------MLNFVGGRLMWGKIEHYFDEYPVRKLIAKTLL

MTH -----------------------------MYINVVKCMWKQIKHRFEGYPSRMYVARKII

MA -------------------------------------MWQTLLSKFEKYPAQAKVLKLLF

MM -------------------------------------MWQTLLKKFEKYPAQAKVLKLLF

MBA -------------------------------------MWQTLLKKFEKYPAQAKVLKLLF

MCB MSNYICMFLCFNGSFIKLILYGYKPLYPYNFRPKVIIMWSTVLNKFEKHPAQQKVIKLLF

Hsp ------------------------------------------MQKFEGSPGQQAVIRLLL

TA -------------------------------------MWSYIYDKFSRSPSQLRIVKKMF

TVN -------------------------------------MWSYIYDKFSRSPSQLKIVKKMI

FAC -------------------------------------MWDYINKVFDNYPAEKKVVQKML

AF -------------------------------------MWKKVAEKFEKYPSQIAVAREFL

Рис. 2. Продолжение

PAB RYGLRVSE----DMKIKAGEIEVPYTKIAKALNVDRRVVKETVAMILKTPELREIYMNLE

PH RYGLRVSE----DMKIKAGEIEVPYTKIAKALNVDRRVVKETVAMILKTPELRDIYMNLE

PF RYGLRVSE----DMKIKAGEIEVPYTKIAKALNVDRRVVKETVAMILKTPELRDIYMNLE

MTH DLGFRIDR----NGKIYCDDVEISDVALARAVGVDRRTVRATANTILEDEKLRGIFENMM

MA ERGFQVNE----EGKVTSGSIEIAHTQLAKEVGVDRRVVDATTKTIISDELLSTIFKNVH

MM ERGFQVNE----EGKVTSGSIEIAHTQLAKEVGVDRRVVDATTKTIISDELLSTIFKNVH

MBA ERGFQVNE----EGKVTSGSIEIAHTQLAKEAGVDRRVVDATTKTIISDELLSRIFRNVH

MCB ERGFQVNG----DGKVTSGSIEIPHTQLAKEAGVDRRVVDATTETILSDELLKNIFQNVT

Hsp ERGFSVND----GGRVVSGGIEIPYTQVAQEAGVDRRVVDSTTEAILDDGELTRIFQNIS

TA SIGIRVTKLYD-EPVLMCGDIEIRPNTLAKATGTDRRSVMSVIERIINDETLYPVFSQLE

TVN STGIKVTKSFDNEPVLMCGDIEIRPNTLAKAAETDRRSVISVINRIANDDKLYPFFSQLE

FAC KIGISVKILYD-EPKLFCESIEIKPNSIARAFHVDRRVIVNMIQKIINDPELFDFFSNLE

AF RLGISVR-----NGKAYCGDIELVPTKIAEAIGVDRKVVLAAIQNIESDEELSKVFSALK

*: : . :*: :*. .**: : * . * .: :

PAB PT-VHMKYVGKHVGYGVIEIEPEPRA-IGILAKVAQKIADRGINIVQAIAEDPELYPEAT

PH PT-VHMKYVGRHVGYGVIEIEPEPRA-IGILARVAQKIADRGINIVQAIAEDPELYPEAT

PF PT-VHMKYVGKHVGYGVIEIEPEPRA-IGILAKIAQKIAEREINIVQVVAEDPELYPEAI

MTH PAGALLRDAAGELDFGVVEIEADARN-PGILAAAARLIADKGISIRQAHAGDPELDETPR

MA SI-PFLRDVAPALGLGVIIIIPEDAAHIGILAEVAGLISKHNVSIRQAVSDDPYLTDNPR

MM SI-PFLRDVAPSLGLGVIIIIPEDAAHVGILAEVAGLISKHNVSIRQAVSDDPYLTDNPM

MBA SI-PFLRDVAPSLGLGVIIIIPEDAADVGILAEVASLISGSKVSIRQAVSDDPYLTDNPR

MCB SI-PFLRDVAPALGLGVIIITPDDAANVGILFSVSQVISNHNISIRQAVSDDPYFNSKAM

Hsp QI-PSLMDLAPVLDLHVVTVAVQDADEPGIVAAVTGLLADHGIPIRQTISEDPEFTDEPR

TA PV-ANLWKVSSKLGYGVIEILPESASKPGIIAGVSSIIAKRGISIRQVIVDDPELVEDPK

TVN PV-ANLWKASVKMGLGVIEIIPESANKPGIIAGISSIIAKHNISIRQVIVDDPEIVEDPK

FAC PM-SNFENSGSKMGFGVIEIIPTDASMPGIIAGVMNVLAESGISVRQFIADDPDLVDNPR

AF PV-ANIAEVARILGFGVLEVYAEST-KVGIVAGVASALANAGISIRYILAEDPELSVESK

: . :. *: : **: :: : : ** : .

PAB LTIITEKPIPGDLINELSKLEGVKRISIY

PH LTIITEKPIPGDLINELSKLEGVKRISIY

PF LTIITEKPIPGDLINELSKLEGVKRISIY

MTH LTIITETPIPGGLLKDFLKIDGVKRVSIY

MA LTIITDHKVPGDLVDDILNLPSVKGVSIY

MM LTIITDNKVPGDLVDEILKLPSVKGVSIY

MBA LTIITDKKVPGELVDKILELPSVKGVSIY

MCB LTIITDSKVPGDIVNEILQLPGVKGVSIY

Hsp LYVVTDEELPGAVFTALAEMSAVRSVELS

TA AVVVTEQKVPPDIIPELKSVEGVRAITIL

TVN AVVVTDQKVPAELIPELRSVDGVKGITIL

FAC AIIVTTNTITGDVLNGIKKARGVKAVML-

AF LTVVTETKIPGAVVEEILRVEGVEKVLIS

::* :. :. : .*. : :

Рис. 3. Филогенетическое дерево для белков, ортологичных MTH1654 из M. thermautotrophicum. Обозначения: MTH - Methanobacter thermoautotrophicus, PAB - Pyrococcus abyssi, PH - Pyrococcus horikoshii, PF - Pyrococcus furiosus, MA - Methanosarcina acetivorans, MM - Methanosarcina mazei, MBA - Methanosarcina barkeri, MCB - Methanococcoides burtonii, AF - Archaeoglobus fulgidus, Hsp - Halobacterium salinum NRC-1, FAC - Ferroplasma acidarmanus, TA - Thermoplasma acidophilum, TVN - Thermoplasma volcanium.

Поиск потенциальных членов триптофанового регулона в геномах архей

После того, как были выбраны геномы, содержащие ортолога белка-регулятора, в них был произведен поиск генов, участвующих в синтезе триптофана. С этой целью был проведен поиск ортологов для всех генов, входящих в триптофановый регулон в M. thermautotrophicus (Таблица 2). Особенно стоит отметить то, что, несмотря на наличие регулятора у P. horikoshii, метаболический путь у данного вида почти полностью отсутствует, что было показано ранее (Xie et al., 2003).

Для некоторых генов в ряде геномов не удалось найти ортологов. При этом в составе оперонов, содержащих гены синтеза триптофана, были найдены гены с неизвестной функцией. Для продуктов этих генов был произведен поиск гомологов при помощи программы BLASTP.

Ряд неортологичных замен наблюдается для 5’-фосфорибозил антанилат изомеразы (trpF) у таких организмов, как Pyrococcus abyssi и P.furiosus, Thermoplasma acidophilum и Archaeglobus fulgidus. Для белков из Pyrococcus abyssi и P.furiosus уровень сходства с ферментом TrpF из Lactobacillus casei, для которого данная функция была определена экспериментально, составляет 30% и 32% соответственно (Natori, 1990). Для этих же видов был показан высокий уровень сходства с TrpF из археи Thermococcus kodakaraensis (уровень сходства 60% и 58% соответственно) и белками из бактерий Clostridium acetobutylicum с меньшим сходством (32%) для P. abyssi, и Listeria innocua для P.furiosus с уровнем сходства 35%. Для TrpF из Thermoplasma acidophilum было обнаружено сходство с белком из Thermoplasma volcanium (48%) , белком из бактерии Lactobacillus casei, но с меньшим сходством (35%). Для белка из A. fulgidus уровень сходства с соответствующим белком из бактерии Lactobacillus casei составляет 31%, так же найдено сходство с белками из ряда архей, например, уровень сходства с белком из Thermococcus kodakaraensis составляет 50%. Для всех найденных TrpF из архей и TrpF из бактерии Lactobacillus casei было построено филогенетическое дерево (Рис. 4). Как видно из рис. 4, все белки TrpF, несмотря на низкий уровень сходства, принадлежат к одному семейству. Ветвь, соответствующая бактериальному белку, выходит из одного общего корня со всеми белками из архей, в результате чего исключается предположение о горизонтальном переносе от бактерий к археям. Таким образом, наиболее вероятным представляется следующее предположение: все белки TrpF архей представляют собой гомологи, далеко разошедшиеся в ходе эволюции. Однако, из-за низкого уровня сходства, используемый алгоритм поиска ортологов не позволяет нам идентифицировать все TrpF, как ортологичные.

Помимо этого наблюдается неортологичные замены альфа-субъединицы триптофан синтазы (TrpA) у рода Thermoplasma. Так для T. acidophilum было найдено сходство с TrpA

Тривиальное название гена

MTH

MCB

MBA

Hsp

FAC

TVN

PAB

MTH1654

068_0059

MM2375

MA1396

AF1020

VNG2296C

166_0095

Ta1106

TVN0456

PAB2435

PF1572

aroC

MTH748

068_0108

MM1712

RMMA08408

aroC

AF0670

aroC

157_0040

Ta0824

TVN0729

aroC

PF1700

pheA

MTH804

VNG1244C

trpB-1

MTH1476

068_0036

MM0337

trpB

AF1240

158_0036

Ta0669

TVN0931

trpB-2

PF1592

tyrA

MTH1640

046_0008

MM1275

MA4595

AF0227

trpE

MTH1655

048_0022

MM2818

RMMA07397

trpE

AF1603

trpE1

158_0031

Ta0806

TVN1024

trpE

PF1709

trpG

MTH1656

MM2817

trpG

AF1602

trpG1

158_0030

Ta0807

TVN1023

trpG

PF1708

trpC

MTH1657

062_0018

MM2823

RMMA07985

trpC

AF1604

trpC

158_0029

Ta0808

TVN1022

PAB2043

PF1711

trpF

MTH1658

MM2819

RMMA08710

trpF

AF1601*

trpF

158_0032

Ta0805*

TVN1025

trpF*

PF1707*

trpB-2

MTH1659

062_0019

MM2822

RMMA08701

AF1600

trpB

trpB-1

PF1706

trpA

MTH1660

062_0020

MM2821

RMMA08700

trpA