работа студентки 2-го курса (стр. 5 из 6)

trpF trpE trpG trpC

Рис.8. Продолжение

Methanococcoides burtonii

trpB1

trpE

trpD

trpC trpB trpA

Поиск потенциальных сайтов связывания белка-регулятора

Используя матрицу, полученную на основании сайтов в геноме M. thermoautotrophicus, нам удалось обнаружить сигналы только в группе, содержащей организмы из рода Methanosarcina и Methanococcoides burtonii, причем сигнал не был обнаружен для M. barkeri. В геномах M. acetivorans и M. mazei потенциальные сайты связывания были найдены перед trp-опероном. С помощью выравнивания регуляторных областей перед данными оперонами, было показано, что сайты расположены в консервативной области, тогда как остальная часть данного межгенного участка является неконсервативной (Рис. 9). Помимо trp-оперона в геномах этих двух видов архей имеется второй ген trpB, перед которым не было обнаружено потенциальных сайтов. У Methanococcoides burtonii сайты были найдены перед всеми генами, отвечающими за синтез триптофана из хоризмата, кроме trpE. Все найденные сайты приведены в таблице 3.

Рис. 9. Выравнивание регуляторных областей перед trp-опероном у M. mazei и M. acetivorans. Найденный сигнал на выравнивании отмечен зеленым цветом. Инициаторные кодоны выделены курсивом и подчеркнуты. Обозначения: MA - M. acetivorans, MMZ - M. mazei.

MA|trpC ------------------------------------------------------------

MMZ|MM2823 AATTGGTCAGGCATTGTTATACGGGTCCATTTTTTACCCCTTTATTTCTACTGGAAAAAT

MA|trpC ---------------------------------------AATGTATGAACAAAATAAATT

MMZ|MM2823 TTAATACAGATTTTTTGTAATTTCAATTTTTGCCTTTAAAATTCATCAAACACCTGAAGA

*** ** ** * * **

MA|trpC TGTTTAATTCGGTTATTCTCATCCTACTGAA-GTTCATTTT-GTCTGTAGCCTTTTTAAC

MMZ|MM2823 TCAAAAGAAGTGTTTCCCATACTTGAGGGAATGTTCATCAGAGTCTATCAGTTTTT---C

* * *** * * * *** ****** **** * **** *

MA|trpC TCGGTTCCTGCAATCTTAAAGAATTTATGTGATGTTTTTGTGTGCTGGCTTTTTCTTC--

MMZ|MM2823 TCAAACTGCATGGCACGACAGCGTTTCTGTGTAGAAATGAACTGTCAGCGATTTCTTCAG

** * ** *** **** * * ** ** *******

MA|trpC --CGAATTTTATTTACAGGTATAAATATAAATAAAACTATTATTATT--TAATCCTCAAA

MMZ|MM2823 CCTGTACCCCGGCAGAACTGATAAATTTACTCAAAATCCGCAGAACTCTTAATCCGTCAC

* * * ****** ** **** * * * ****** *

MA|trpC ATTTTATAA---AATCAGCAACAGTTTATCCTCATCCAAAAGCTTTTTATAGCAAGTATG

MMZ|MM2823 TTCTAAGTGGTTACTTTTTAAACTCCTGTCATCATCCGAAATCTTTTTATATCAAGTACA

* * * * * ** * ** ****** *** ********* ******

MA|trpC GTATTAGACATTGTTGTACACAAATATACACCAGTGATGATTA----------

MMZ|MM2823 GCATTAGACATTGTTGTACACAACTATACGTCAGTGATTCATAATGCACGATT

* ********************* ***** ******* **

Табл. 3. Предполагамые сайты, найденные в регуляторных областях.

Организм	Оперон	Положение	Вес	Сайт
M. thermoautotrophicus	regulator	-8	7.50	TGTAtA-4-TGTACA
M. thermoautotrophicus	aroC	-86	5.65	gGTACA-5-cGTAtA
M. thermoautotrophicus	pheA	-71	6.62	TGgACA-5-gGTACA
M. thermoautotrophicus	trpB-1	-103	8.47	TGTACA-4-TGTACA
M. thermoautotrophicus	tyrA	-135	5.65	TGgACc-5-TGTtCA
M. thermoautotrophicus	trpEGCFB-2AD	-86	7.51	TGTACA-4-TaTACA
M.mazei	trpCGEFB	-48	8.98	aGTACA-4-TagACA-4-TGTACA
M.acetivorans	trpСGEFB	-38	8.97	TagACA-4-TGTACA-4-TaTACA
Methanococcoides burtonii	trpD	-7	9,95	TaTACA-4-TGTACA-4-TGTACA
Methanococcoides burtonii	trpCBA	-39	9,31	TGTACA-4-TaTACt-4-TGTACA
Methanococcoides burtonii	trpB-1	-91	5,68	TGTAat-4-TGTACA
Methanococcoides burtonii	trpB-1	-41	7,07	TcTACA-4-aGTACt-4-TGTgCA

Построение филогенетического дерева для белков ТrpB

Присутствие в некоторых геномах двух генов для бета-субъединицы триптофан синтазы (ТrpB) наводит на мысль о дупликации данного гена в ходе эволюции. Оба гена trpB (trpB1 и trpB2) есть только в некоторых из изучаемых геномах: M. thermautotrophicus, P. abyssi, P. furiosus, M. mazei, M. barkeri, M. burtonii, A. fulgidus. В остальных случаях встречается только один из генов trpB. С целью прояснить филогенетические соотношения между ферментами ТrpB, найденными в каждом из геномов, было построено филогенетическое дерево для всех найденных белков ТrpB (Рис. 10). На дереве отчетливо можно выделить две группы ферментов, соответствующих TrpB1 и TrpB2. Как становится понятным из анализа дерева, дупликация скорее всего произошла еще до расхождения исследуемых организмов по группам, и является, таким образом, достаточно древней. В дальнейшем, по всей видимости, в ходе эволюции различных групп происходила утрата одного из trpB генов. Кроме того, нами была показана ошибка в аннотации генома P. abyssi. Ген, проаннотированный у P. abyssi как trpB2, на самом деле относится к группе trpB1.

Бактериальные гомологи были найдены только для TrpB2 (см. Рис. 10). Таким образом, TrpB1 представляет собой белок, характерный для архей, тогда как скорее всего появился в результате горизонтального переноса от бактерий. Следовательно, TrpB1 и TrpB2 являются ксенологами (Koonin et al., 2001).

Поиск регуляторных сигналов в группе, соответствующей роду Pyrococcus, и группе, отвечающей родам Ferroplasma и Thermoplasma

Поиск регуляторных сигналов у рода Pyrococcus

Используя имеющуюся у нас матрицу, не удалось обнаружить потенциальных сайтов перед генами синтеза триптофана в геномах P. abyssi и P. furiosus. Поэтому для поиска сайтов нами был применен метод генетического футпринтинга. В основе этого метода лежит поиск консервативных последовательностей перед ортологичными генами из родственных геномов с помощью выравнивания. (Florea et al., 2003; McCue et al., 2001)

Рис. 10. Филогенетическое дерево белков ТrpB. Обозначения: Археи: PAB - Pyrococcus abyssi, PF - Pyrococcus furiosus, MA - Methanosarcina acetivorans, MM - Methanosarcina mazei, MBA - Methanosarcina barkeri, MCB - Methanococcoides burtonii, AF - Archaeoglobus fulgidus, Hsp - Halobacterium salinum NRC-1, FAC - Ferroplasma acidarmanus, TA - Thermoplasma acidophilum, TV - Thermoplasma volcanium, MTH - Methanobacter thermoautotrophicus. Бактерии: THM - Thermotoga maritima, CLA - Clostridium acetobutylicum, AQ - Aquifex aeolicus, CV - Caulobacter vibrioides.

Парное выравнивание регуляторных областей перед оперонами, содержащими только гены синтеза триптофана, у P. abyssi и P. furiosus показало, что эти регуляторные области не имеют ярко выраженных консервативных участков, поэтому явным образом не удается выделить регуляторные сайты.

Поиск регуляторного сигнала по консенсусу, известному для аналогичного сигнала перед генами M. thermoautotrophicus, не дал никаких результатов. В большинстве случаев в регуляторных областях удавалось найти лишь один короткий палиндром длины 6, вероятность встретить который случайно очень велика, поэтому нельзя предполагать, что это искомый регуляторный сигнал.

Так как белки-регуляторы ортологичны, разумно предположить, что структура сигнала в геномах представителей рода Pyrococcus будет частично сохранена. Можно предположить, что в данном случае сохранится общий план строения сигналов, но возможны некоторые изменения в консенсусе палиндромных сайтов; также возможно и изменение расстояния между палиндромными боксами. При помощи программы SignalX был осуществлен поиск коротких палиндромов в регуляторных областях. Были найдены только единичные палиндромы с низким весом. Таким образом, у архебактерий рода Pyrococcus либо сильно изменилась структура регуляторного сайта, либо регуляция синтеза триптофана имеет совершенно другой механизм.

Поиск регуляторных сигналов в группе, отвечающей родам Ferroplasma и Thermoplasma.

Поиск в данном случае осуществлялся такими же методами, как и для рода Pyrococcus.

Поиск сигналов вместе у родов Ferroplasma и Thermoplasma не дал результатов, так как, видимо, представители этих родов все-таки достаточно далеко разошлись в ходе эволюции.

При поиске внутри рода Thermoplasma, также не удалось выявить консервативный регуляторный сигнал. Выравнивание регуляторных областей не дало никакого результата, так как регуляторные области оказались малоконсервативны.