Микроорганизмы, выделенные из различных природных жиров (стр. 10 из 21)
Для измерения рабочего образца устанавливают пробу. Нажимают «пуск», снимают показания индикатора в соответствии литературными данными.
2.2.20 Определение содержания несвязанных жировых веществ (ГОСТ 26129-84 Шкурки меховые и овчина шубная выделанные. Методы определения несвязанных жировых веществ)
Навеску измельченной кожевой ткани или волоса массой 0,5-0,6 г взвешенною с погрешностью не более 0,0002 г, помещают в бумажную гильзу и закрывают тампоном. Гильзу закрепляют в предварительно доведенной до постоянной массы колбе и соединяют колбу с обратным холодильником. В колбу заливают 50 см3 хлороформа или дихлорэтана. Колбу с растворителем нагревают на электрической плитке с асбестовым покрытием. Продолжительность экстрагирования при анализе кожевой ткани - 45 минут, при анализе волоса – 15-20 минут. Растворитель должен постоянно кипеть и, охлаждаясь и стекая с холодильника, попадать в центр гильзы. В дальнейшем растворитель отгоняют и колбу с жировыми веществами доводят до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 128-130˚С. Продолжительность первой сушки 30 минут, последующих – по 15 минут.
Массовую долю жировых веществ вычисляют по формуле (8):
Х1 =
×100, (8)где Х1– массовая доля жировых веществ;
m– масса колбы с экстрагированными веществами, г;
m1 – масса пустой колбы, г;
m2 – масса навески кожевой ткани или волоса, г.
3 Экспериментальная часть
В настоящее время проблема загрязнения водного бассейна антропогенными сбросами во всем мире стоит на первом месте. Для региона республики Бурятия эта проблема является наиболее важной, так как на нашей территории находится мировое наследие – озеро Байкал. Характер стоков, поступающих в водный бассейн достаточно разнообразен, так как на территории республики находится довольно много средних и мелких предприятий по переработке пушно-мехового сырья, по производству мясной и молочной продукции, немаловажное значение имеет загрязнение бытовыми стоками. К основным загрязнителям стоков пушно-меховых предприятий относятся соли хрома (III) и (VI), красители, ПАВ, а также жировые вещества, которые образуются при проведении процессов отмоки и обезжиривания. При очистке сточных вод, содержащих жировые вещества, на первом этапе применяют физические и физико-химические методы очистки, наиболее распространенным из которых является метод флотации, на последующих этапах очистки большое распространение получили биологические методы, основанные на применении микроорганизмов-деструкторов жировых веществ. Известно, что деструкция жира на первом этапе происходит до глицерина и карбоновых кислот (основных составляющих в структуре жиров), интерес представляют последующие продукты деструкции. В связи с этим, целью дипломной работы являлось изучение морфолого-культуральных свойств микроорганизмов, выделенных из жировых материалов и из сточных вод после процесса обезжиривания, и исследование деструкции жировых веществ прокариотическими микроорганизмами.
3.1 Восстановление и исследование морфолого-культуральных свойств микроорганизмов, деструктирующих жировые вещества
С целью восстановления свойств микроорганизмов в жидкие питательные среды объемом 150 см3 на основе мясопептонного бульона (МПБ) и синтетической среды Рана, в которой в качестве источника углерода служил нерпичий жир (п.2.2.1), внесли исследуемые культуры в количестве 105 кл/ см3 (петлей). Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 250 см3 в термостате марки «ТС-80М-2» при температуре (37±0,5)˚С в течение 24 часов в состоянии покоя. После истечения заданного времени культивирования перенесли 0,1 мл. бактериальной суспензии и произвели посев на соответствующие плотные среды в чашки Петри.
Для исследования морфолого-культуральных свойств прокариотических организмов была восстановлена культура микроорганизмов методом штриха и разведений (п.п.2.2.2-2.2.3) на мясопептонном агаре (МПА) и на синтетической среде Рана. Культивирование проводили в перевернутых чашках Петри в термостате при температуре (37±0,5)˚С в течение 24 часов для МПА и 48 часов для среды Рана.
Выделенные культуры были обозначены следующим образом: Нв – микроорганизмы, выделенные из жира нерпы, но адаптированные к росту на шерстном жире; Н – микроорганизмы, выделенные из жира нерпы; В – выделенные из шерстного жира; 3, 8 – культуры микроорганизмов, выделенные из сточных вод после проведения процесса обезжиривания меховой овчины.
При рассмотрении характера роста культур на разных средах можно отметить, что колонии микроорганизмов, выращенных на мясопептонном агаре, характеризуются более значительными размерами, по сравнению с культурами, выращенными на синтетической среде Рана, что обусловлено повышенной чувствительностью культур к агрессивной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода нерпичий жир, в количестве 1 г/дм3.
Исследование морфолого-культуральных свойств, выделенных колоний микроорганизмов проводили по следующим параметрам: окрашиванию по методам Грама, Трухильо и Леффлеру (п.2.2.4), определение подвижности методом раздавленной капли (п.2.2.6) и определение культуральных свойств (п. 2.2.5).
Результаты исследования морфолого-культуральных свойств бактерий представлены в таблице 3 и на рисунках А1-А5.
Таблица 3 – Сравнительная таблица морфолого-культуральных признаков исследуемых культур
| Признак | Тип культуры | ||||||
| Н | Нв | В | 3 | 8 | |||
| Место выделения | Природные жиры: шерстный, нерпичий. | Сточные воды после проведения процесса обезжиривания | |||||
| Морфология | Коккобактерии | Палочки, сцепленные попарно и более | |||||
| Рельеф колоний | Плоские | ||||||
| Прозрачность | Непрозрачная | ||||||
| Края колонии | Ровные | ||||||
| Структура колонии | Гомогенная | ||||||
| Консистенция | Мазеобразная | ||||||
| Окраска по Граму | + | + | + | + | + | ||
| Окраска по Трухильо | - | - | - | - | |||
| Окраска по Леффлеру | + | + | + | + | + | ||
| Подвижность | + | + | + | + | + | ||
| Расположение жгутиков | Перетрихи | ||||||
| рН (опт) | 5,6-7,5 | ||||||
| Температура (опт), оС | 25-40 | ||||||
| Форма колоний | Точечная | ||||||
Окрашивание мазков показало, что все культуры являются грамположительными мелкими палочками, аспорогенными с перетрихиальным расположением жгутиков. Более подробно форму бактерий можно рассмотреть на рисунках 2-6, полученных в результате фотографирования окрашенных мазков на микроскопе Ломо Микмед–1 с помощью цифрового фотоаппарата «Samsung». По форме бактерий культуры типа Н, Нв и В следует отнести к коккобактериям – мелким палочкам, близким к овальной форме, в то время как культуры типа 8, 3 представляют собой бактерии, диплобактерии и стрептобактерии. Размер исследуемых микроорганизмов варьируется в пределах 0,1-0,5 нм.
При рассмотрении раздавленной капли бактериальной суспензии было отмечено броуновское движение бактерий, сопровождающееся вращательным движением, обусловленным перетрихиальным расположением жгутиков.
Результаты изучения культуральных свойств представлены на рисунках А6-А10. При изучении культуральных свойств установлено, что все культуры имеют точечные колонии матового цвета, непрозрачные, с ровными краями.
Для определения липолитической активности был произведен посев в бульон Штерна, содержащего в качестве субстрата глицерин. Посев производили следующим образом: для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов производили посев на скошенную синтетическую среду и культивировали в течение 24 часов при температуре (37±0,5)˚С, затем произвели смыв полученной биомассы 10 см3 бульона Штерна в пробирки, и термостатировали при температуре (37±0,5)˚С в течение 120 часов в термостате марки «ТС-80М-2».
При рассмотрении поведения культур в данной среде выявлено, что уже к 24-48 часам культивирования имело место переход окраски бульона из розового в ярко – красный (рисунок А11), образование хлопьевидного осадка и газообразование. К 72 часам культивирования наблюдалось появление биопленки и пристеночного кольца, а к 96 часам посветление сред до светло-розового цвета. При рассмотрении окраски по столбу жидкости была отмечена ее дифференсация: окраска была более интенсивной в верхней части жидкости, что возможно обусловлено более высоким содержанием кислорода в этом слое. Следовательно, для роста данных микроорганизмов необходим кислород.
Также было отмечено изменение активной реакции среды (рН=7 контрольной пробы). Через 24 часа культивирования после заражения бульона Штерна при температуре (37±0,5)˚С произошло понижение рН с 5 до 3 для всех исследуемых сред за исключением сред, содержащих культуру 8, активная реакция которой сохранялась в течение 72 часов и составляла рН=4, а к 120 часам культивирования повысилась до рН=5. Для остальных культур было характерно плавное повышение активной реакции среды до рН=5 к окончанию культивирования (120 часов).
На основе проведенных исследований следует отметить, что исследуемые культуры микроорганизмов обладают липолитической активностью, т.е. вовлекают вещества жировой природы (в качестве источника углерода) в конструктивный и энергетический обмен, что заметно по таким показателям среды как: появление хлопьевидного осадка, изменение цвета от восстановления индикатора при изменении рН. Однако выявления культуры с чётко выраженной максимальной величиной активности по липазе не было – наблюдается одинаково равнозначные характеристики роста на специализированной среде в течение всего периода культивирования.